血清樣本雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法學(xué)研究

趙 欣，蒲小平，肖衛(wèi)忠

(1.天然藥物及仿生藥物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京大學(xué))，2.北京大學(xué)藥學(xué)院分子與細(xì)胞藥理學(xué)系，3.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京 100191)

患者血清在臨床上較容易獲得，且蘊(yùn)含著重要的生物學(xué)信息。因此對(duì)患者血清中蛋白質(zhì)表達(dá)變化的研究，對(duì)于發(fā)現(xiàn)疾病特異性的生物標(biāo)記物以及藥物干預(yù)、疾病相關(guān)的關(guān)鍵蛋白具有重要意義［1］。血清蛋白質(zhì)組學(xué)是指研究選定目標(biāo)人群的血清中表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，尋找其差異蛋白質(zhì)，鑒定藥物干預(yù)疾病或疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而研究其結(jié)構(gòu)和功能。它是尋找疾病生物標(biāo)記物的最有效手段之一。生物標(biāo)記物已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究、藥物研發(fā)、臨床檢驗(yàn)等方面的主力軍。檢查幾種疾病特異性的生物標(biāo)志物，對(duì)于疾病的鑒定、早期診斷及預(yù)防、治療過(guò)程中的監(jiān)控可能起到幫助作用。此外，通過(guò)血清蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，還可以進(jìn)行疾病發(fā)病機(jī)制的探討以及藥物治療靶點(diǎn)的篩選。因此，血清蛋白質(zhì)組學(xué)正是實(shí)用的技術(shù)手段之一，其結(jié)果將為闡明藥物治療疾病的機(jī)制以及臨床的診斷提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

目前，血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法較多采用雙向電泳(two-dimensional gel electrophoresis，2-DE)聯(lián)合生物質(zhì)譜技術(shù)，但由于血清樣本的特有性質(zhì)使得2-DE分辨率較低，許多低豐度蛋白信息丟失。為此，我們對(duì)血清2-DE的多種實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期建立重復(fù)性更好、分辨率更高的血清2-DE實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑血清樣本取自北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)科。CHAPS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺等為Sigma公司產(chǎn)品。尿素、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇(DTT)為Merck公司產(chǎn)品。固相pH梯度干膠條(pH 4～7，17 cm)和兩性電解質(zhì)等其他雙向電泳試劑均購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 儀器等電聚焦儀(Protean?IEF System)，垂直電泳系統(tǒng)(Protean?Ⅱ xi cell)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 血清收集 血液樣本均由專(zhuān)業(yè)人員由靜脈穿刺獲得。抽取血液后，立即以1 000×g離心10 min，分離血清。血清樣品分裝后儲(chǔ)存于－80℃冰箱備用。

1.3.2 血清中高豐度蛋白的去除 為獲得分離度較好的血清2-DE蛋白表達(dá)圖譜，在2-DE進(jìn)行前，先去除血清中的白蛋白，用文獻(xiàn)［2］的方法進(jìn)行優(yōu)化。首先用預(yù)冷的含有10%(W/V)三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)的丙酮沉淀蛋白，混合物在－20℃條件下放置90 min。之后，在4℃，15 000×g離心20 min。棄去上清，加入預(yù)冷丙酮清洗沉淀，充分混勻后，在冰上放置15 min，之后再次4℃，15 000×g離心20 min，棄去上清。再重復(fù)此步驟3次。凍干蛋白質(zhì)沉淀后用含有蛋白酶抑制劑混合物的上樣緩沖液(7 M urea，40 mmol·L－1Tris，pH 7.4，65 mmol·L－1DTT，2%CHAPS)溶解該沉淀蛋白作為2-DE上樣樣品。

1.3.3 雙向電泳 樣品用Bradford法定量試劑盒(普利來(lái)公司)定量后上樣。2-DE按文獻(xiàn)［3］報(bào)道的方法稍做改進(jìn)進(jìn)行。取含蛋白質(zhì)800 μg的樣品，于50 V電壓下主動(dòng)水化16 h。升壓程序依次為250 V線性升壓30 min，1 000 V快速升壓1 h，10 000 V線性升壓5 h，10 000 V快速升壓至70 000 V·h。等電聚焦結(jié)束之后，進(jìn)行膠條平衡。然后以60 mA恒流進(jìn)行分離膠濃度為12.5%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.3.4 硝酸銀染色 染色前用固定液(50%甲醇，10%冰醋酸)固定過(guò)夜。之后，凝膠在敏化液(30 mmol·L－1K3［Fe(CN)6］和 30 mmol·L－1Na2S2O3)中敏化 2 min，去離子水洗膠4次，每次10 min。用銀氨染液染膠15 min，染液配制方法參照伯樂(lè)公司雙向電泳技術(shù)手冊(cè)，為:0.36%氫氧化鈉105 ml加入30%氨水8.5 ml，然后加入20%硝酸銀 20 ml(逐滴加入)，最終定容至500 ml，臨用前新鮮配制。染膠后用去離子水洗膠2次，每次5 min，然后顯色液(5 mg·L－1檸檬酸、9.5 mg·L－1甲醛)顯色至理想程度，用1%冰醋酸終止顯色。染色后用凝膠成像系統(tǒng)獲取雙向電泳圖譜。

1.3.5 蛋白質(zhì)鑒定和數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 從雙向電泳凝膠上切下蛋白蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，置于0.5 ml的Eppendorf管中，按文獻(xiàn)［4－5］的方法處理樣品。MS/MS質(zhì)譜分析在美國(guó)Waters公司的Micromass ESI-Q-TOF Ultima Global質(zhì)譜儀上進(jìn)行。根據(jù)得到的信息，利用因特網(wǎng)上Mascot search engine檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.matrixscience.com)，尋找匹配的蛋白質(zhì)，檢索參數(shù)設(shè)置:物種為人類(lèi)(Homo Sapian)，酶為胰蛋白酶(trypsin)，單同位素質(zhì)量(Monoisotopic)，肽段質(zhì)量容忍偏差(peptides mass tolerance)±1 u，碎片離子質(zhì)量容忍偏差(fragmentions mass tolerance)±0.2 u，最大胰酶漏切位點(diǎn)數(shù)(max missed cleavage)為1。

2 結(jié)果

2.1 血清高豐度蛋白去除實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)［1］的描述的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行，主要優(yōu)化用預(yù)冷丙酮清洗TCA/丙酮沉淀下來(lái)的蛋白質(zhì)沉淀的次數(shù)。清洗不同次數(shù)(1～6次)后進(jìn)行SDSPAGE電泳后的結(jié)果見(jiàn)Fig 1。SDS-PAGE采用12.5%的凝膠，染色方法為考馬斯亮藍(lán)染色。結(jié)果顯示，用預(yù)冷丙酮洗蛋白沉淀至少4次，才能使TCA的殘留酸性不致明顯影響電泳結(jié)果，因此，用預(yù)冷丙酮洗蛋白沉淀4次為最佳實(shí)驗(yàn)方案。

Fig 1 2-DE maps of human serum dealt with different wash times of acetone after precipitation

2.2 硝酸銀染色方法的優(yōu)化為得到更為清晰的2-DE圖譜，我們對(duì)硝酸銀染色方法也進(jìn)行了改進(jìn)。根據(jù)伯樂(lè)公司雙向電泳技術(shù)手冊(cè)中的硝酸銀染色方法進(jìn)行染色，效果不理想，而且染色速度較慢，顯現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)較少，因此，我們?cè)诖朔椒ǖ幕A(chǔ)上，加入了敏化步驟，結(jié)果見(jiàn)Fig 2。圖中圈出的區(qū)域即為蛋白斑點(diǎn)染色明顯改進(jìn)區(qū)域。Fig 2A為沒(méi)有敏化步驟的染色方法得到的結(jié)果，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目較少，背景較高;Fig 2B為加入了敏化步驟的染色方法，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目明顯增多，且背景有所降低，對(duì)比度比較好，更有利于后期的軟件分析以及差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的比對(duì)和尋找。

為驗(yàn)證這種敏化步驟不會(huì)對(duì)后續(xù)的生物質(zhì)譜分析產(chǎn)生影響，我們對(duì)染色后凝膠上的一個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜分析，得到其多肽序列信息見(jiàn)Fig 3A。根據(jù)所得肽段信息，通過(guò)Mascot search engine檢索NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢(xún)與之相匹配的蛋白，結(jié)果為β-2-糖蛋白1(beta-2-glycoprotein 1)，詳細(xì)肽段匹配情況見(jiàn)Fig 3B。結(jié)果可見(jiàn)，本文所述優(yōu)化的硝酸銀染色方法中敏化步驟的引入并不會(huì)影響到后續(xù)的生物質(zhì)譜分析，我們應(yīng)用該方法進(jìn)行的其它血清蛋白質(zhì)組學(xué)的研究(資料未顯示)也表明，這是一種質(zhì)譜兼容的并且具有更高靈敏度和信噪比的硝酸銀染色方法。

3 討論

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人類(lèi)疾病相關(guān)機(jī)制的研究，并且經(jīng)常用于差異表達(dá)蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和生物標(biāo)記物的篩選。應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)血清中各種蛋白質(zhì)的變化情況進(jìn)行研究，可以為疾病病理機(jī)制的探討、疾病特異生物標(biāo)記物的尋找以及新藥物靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)提供大量的重要生物信息，具有重要的理論和實(shí)際意義。

Fig 2 2-DE maps stained by different methods of silver nitrate staining

Fig 3 MS analysis and identification of the protein spot

蛋白質(zhì)組學(xué)研究最經(jīng)典的技術(shù)路線為電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用。雖然近年來(lái)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展迅速，很多新的技術(shù)方法不斷涌現(xiàn)，如:同位素親和標(biāo)簽、多維高效液相色譜以及生物芯片等，但是雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用進(jìn)行分離和鑒定蛋白質(zhì)仍然是蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究最基本和最主要的技術(shù)手段。這種方法適用于大多數(shù)樣本，包括細(xì)胞(如原代培養(yǎng)細(xì)胞或各種細(xì)胞系)、組織(如肝臟、腦、腎等)、體液(如血清、腦脊液、尿液)等。但利用雙向電泳的方法分離血清蛋白質(zhì)時(shí)，由于白蛋白、IgG等高豐度蛋白的干擾，許多重要的低豐度蛋白不能被分離出來(lái)，所得到的血清蛋白圖譜分辨率較低，效果不理想，重復(fù)性和穩(wěn)定性也較差［6］。尋找適用于血清樣本的雙向電泳實(shí)驗(yàn)方法一直是相關(guān)領(lǐng)域研究的難點(diǎn)問(wèn)題。因此，為得到分辨率更高、重復(fù)性更好的血清雙向電泳技術(shù)方案，憑借多年來(lái)在蛋白質(zhì)組學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)積累［7～9］，我們對(duì)樣品預(yù)處理方案和硝酸銀染色方法等進(jìn)行了優(yōu)化，期望得到更為理想的血清蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。

在血清樣品預(yù)處理實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)TCA/丙酮用于血清樣本中白蛋白的去除不僅效果較好，而且更為經(jīng)濟(jì)，其處理結(jié)果的關(guān)鍵就在于去除TCA酸性對(duì)電泳實(shí)驗(yàn)影響的同時(shí)盡少的損失需要保留的蛋白。因此，丙酮洗脫蛋白沉淀的次數(shù)尤為關(guān)鍵。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)4次是使TCA酸性不對(duì)后續(xù)電泳產(chǎn)生明顯影響的最少清洗次數(shù)，為較為理想的方案。在硝酸銀染色方面，我們希望得到一種靈敏度和信噪比更高且能夠兼容質(zhì)譜分析的染色方法，以適用于血清樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。通過(guò)敏化步驟的加入，這一目的得以實(shí)現(xiàn)，蛋白質(zhì)斑點(diǎn)明顯增多，同時(shí)背景有所降低，且不會(huì)影響后續(xù)的質(zhì)譜分析。此外，這種方法顯色速度適中，染色效果重復(fù)性好，使得硝酸銀染色尤其是在大型凝膠實(shí)驗(yàn)中的染色程度能夠更好的被控制。

總之，本研究通過(guò)對(duì)2-DE的血清樣品預(yù)處理方案和硝酸銀染色方法等環(huán)節(jié)的不斷調(diào)整和優(yōu)化，建立了適合于血清樣本的2-DE實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案，結(jié)果較為穩(wěn)定，具有高分辨率和很好的重復(fù)性，對(duì)于相關(guān)血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有良好的參考價(jià)值。

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