NVP-AAM077和Ro25-6981對(duì)全腦缺血小鼠海馬神經(jīng)元損傷及BDNF表達(dá)的影響

陳遠(yuǎn)壽，羅孝美，陳 旻，張 弛

(1.遵義醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563003;2.中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所神經(jīng)科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200031)

缺血性腦卒中是臨床常見的急性腦血管病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率的特點(diǎn)，是中老年人致死和致殘的主要疾病。N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR or NR)介導(dǎo)的谷氨酸神經(jīng)興奮毒性在缺血性腦損傷的眾多環(huán)節(jié)中起著關(guān)鍵性的作用，它是由不同亞單位(功能亞單位NR1和調(diào)節(jié)亞單位NR2A～NR2D)組成的異聚體［1］。近來(lái)研究表明［2，3］，大鼠海馬 NR2A 和NR2B在缺血性腦損傷中可能起著不同的作用。但NR2A和NR2B亞基在腦缺血性損傷發(fā)展進(jìn)程中的作用及分子機(jī)制，目前尚未完全清楚。本文以小鼠全腦缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)模型為研究對(duì)象，用特異性NR2A和NR2B的拮抗劑處理，探討NR2A和NR2B在小鼠海馬神經(jīng)元缺血損傷中的作用及可能機(jī)制，為進(jìn)一步研制和開發(fā)針對(duì)NR2A與NR2B的特異性新藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品NVP-AAM077(NR2A特異性性拮抗劑)由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院藥物研究所合成，先前的研究已證實(shí)了其特異性［3，4］;Ro25-6981(NR2B特異性拮抗劑)購(gòu)自Sigma公司;兔抗BDNF多克隆抗體和兔抗β-actin多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 動(dòng)物分組48只♂C57BL/6小鼠，體重20～25 g(由中國(guó)科學(xué)院上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham group)、腦缺血/再灌注對(duì)照組(I/R control group)、NVP-AAM077干預(yù)組(NVP+I/R group)和Ro25-6981干預(yù)組(Ro+I/R group)。每組12只。兩干預(yù)組小鼠于缺血前30 min腹腔內(nèi)分別注射NVP-AAM077(5.0 mg·kg－1)和Ro25-6981(6.0 mg·kg－1)，sham 組和 I/R 對(duì)照組在術(shù)前30 min注射等容量生理鹽水。

Fig 1 Effect of NVP-AAM077 or Ro25-6981 on the neuron loss induced by transient global ischemia

1.3 小鼠全腦缺血/再灌注模型的制作參照文獻(xiàn)［5］制備三血管阻塞(3-VO)全腦缺血模型。小鼠用10%水合氯醛(300 mg·kg－1，i.p.)麻醉后，在解剖顯微鏡下分離出兩側(cè)頸總動(dòng)脈和基底動(dòng)脈，分別用小動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈和用微型動(dòng)脈夾(用直徑為0.2 mm的不銹鋼鋼絲制作而成，日本東京FUJITA醫(yī)療器械有限責(zé)任公司定制)夾閉基底動(dòng)脈，在顯微鏡下證實(shí)動(dòng)脈血流被阻斷，造成小鼠全腦缺血12 min后，置小鼠于30℃的恒溫保育箱內(nèi)進(jìn)行再灌注3 d，在手術(shù)造模和再灌注期間均應(yīng)監(jiān)測(cè)小鼠體溫，使之維持在37℃左右。Sham組小鼠進(jìn)行同樣的手術(shù)處理，但不進(jìn)行三血管阻塞。

1.4 Fluoro-Jade B(FJB)染色海馬冠狀冰凍切片(20 μm)，浸入100%乙醇5 min，70%乙醇2 min，ddH2O 2 min，0.06%KMnO415 min，ddH2O 1 min，避光下0.000 5%FJB儲(chǔ)液20 min(美國(guó)Histo-Chem公司)，ddH2O 1 min×3，室溫干，DPX封片。熒光顯微鏡(日本Nikon公司)下觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞變性死亡情況。

1.5 Nissl染色海馬冠狀冰凍切片(20 μm)，浸入1∶1乙醇和氯仿溶液中 30 min，梯度乙醇(100%、95%、80%、70%、60%、50%)分化，蒸餾水沖洗后用甲酚紫染液浸染30 min，蒸餾水洗，用梯度乙醇(50%、60%、70%、80%、95%、100%)脫水，二甲苯透明(5 min1次×2次)，DPX封片，顯微鏡明場(chǎng)下觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化。各組選取切片6張，在顯微鏡下對(duì)海馬CA1區(qū)存活神經(jīng)元計(jì)數(shù)分析。

1.6 腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表達(dá)的檢測(cè)參照文獻(xiàn)［6，7］行 Western blot，其中一抗為兔抗 BDNF(1 ∶1 000)，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠二抗(1∶2 000)，膠片曝光顯影后，結(jié)果以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間樣本定量資料比較應(yīng)用One-way ANOVA分析。

2 結(jié)果

2.1 特異性NR2A和NR2B拮抗劑對(duì)腦缺血小鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響sham組小鼠海馬神經(jīng)元未見F-JB陽(yáng)性細(xì)胞，I/R組、NVP和Ro干預(yù)組在腦缺血12 min/再灌注3 d后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)FJB陽(yáng)性細(xì)胞，表明CA1區(qū)神經(jīng)元出現(xiàn)了遲發(fā)性變性死亡;同時(shí)，Nissl染色和定量分析顯示，與sham組比較，I/R組、NVP和Ro干預(yù)組CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量均減少(P＜0.01或P＜0.05);Ro干預(yù)組CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量明顯多于I/R組(P＜0.01)，NVP干預(yù)組CA1區(qū)神經(jīng)元存活數(shù)量明顯低于I/R組(P＜0.05)，見Fig 1。

2.2 特異性NR2A和NR2B拮抗劑對(duì)腦缺血小鼠海馬BDNF表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示，I/R組和Ro干預(yù)組海馬組織BDNF蛋白表達(dá)與sham組相比均明顯增加(P＜0.01);NVP干預(yù)組的BDNF蛋白表達(dá)明顯低于I/R組(P＜0.01)，而Ro干預(yù)組BDNF蛋白表達(dá)高于與I/R組(P＜0.05)，見Fig 2。

Fig 2 Effect of NVP-AAM077 or Ro25-6981 on the expression of BDNF in the hippocampus of transient global ischemia mice

3 討論

腦缺血/再灌注后，興奮性谷氨酸過(guò)度激活NMDA受體導(dǎo)致神經(jīng)元胞內(nèi)鈣超載而觸發(fā)的系列生化改變和誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)可能是導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的重要原因［1，8－9］，而該受體通道的調(diào)控在缺血性腦卒中的治療中可能是重要的靶點(diǎn)。NMDA受體主要由NR1、NR2(NR2A-NR2D)和NR3亞基組成，功能性的 NMDA 受體由 NR1和 NR2共同組成［1－3］。NR2亞基在缺血性腦損傷中起著非常重要的作用，尤其是NR2A和NR2B在腦缺血和預(yù)缺血耐受中可能有不同的作用。NR2A和NR2B的亞細(xì)胞定位不同決定了它們?cè)谀X缺血/再灌注后所起的作用不同，NR2A主要分布在成熟神經(jīng)元的突觸上，而NR2B則主要分布于突觸外的細(xì)胞膜上［10－11］，研究表明，激活突觸上的NMDA受體促進(jìn)神經(jīng)元存活，而激活突觸外的NMDA受體會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡［12－13］。Chen 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷大鼠的 NR2A后可削弱預(yù)缺血耐受的神經(jīng)元保護(hù)作用，抑制CREB的磷酸化及其下游基因cpg15和BDNF mRNA的表達(dá)，而阻斷NR2B后起相反的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用NVP-AAM077阻斷小鼠的NR2A后，加重了腦缺血引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡，而用Ro25-6981阻斷NR2B后，可明顯減輕腦缺血引起的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元死亡。提示NR2A和NR2B在小鼠腦缺血引起神經(jīng)元損傷中起著不同的作用。

BDNF是腦中含量最多的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、成熟、維持神經(jīng)元生長(zhǎng)的功能。研究表明［3，6，14］，腦 缺 血損傷 時(shí)，BDNF 及 其受體TrkB表達(dá)均增加，對(duì)受損細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)以及恢復(fù)有著重要的作用。本研究顯示，在腦缺血早期，海馬BDNF蛋白表達(dá)上調(diào)，現(xiàn)在認(rèn)為這可能是一種缺血引起的反應(yīng)性上調(diào)，是對(duì)缺血損傷做出的保護(hù)性反應(yīng)，有利于受損細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)及修復(fù);阻斷NR2A可下調(diào)小鼠海馬組織BDNF蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致存活細(xì)胞減少，而阻斷NR2B可上調(diào)小鼠海馬組織BDNF蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞存活增加，這可能就是NR2A和NR2B在小鼠腦缺血引起神經(jīng)元存活和死亡中起著不同作用機(jī)制之一。

［1］ Martin H G，Wang Y T.Blocking the deadly effects of the NMDA receptor in stroke［J］.Cell，2010，140(2):174 －6.

［2］ Liu Y，Wong T P，Aarts M，et al.Nmda receptor subunits have differential roles in mediating excitotoxic neuronal death both in vitro and in vivo［J］.J Neurosci，2007，27(11):2846 －57.

［3］ Chen M，Lu T J，Chen X J，et al.Differential roles of NMDA recep-tor subtypes in ischemic neuronal cell death and ischemic tolerance［J］.Stroke，2008，39(11):3042 －8.

［4］ Chen Q，He S，Hu X L，et al.Differential roles of nr2a-and nr2bcontaining nmda receptors in activity-dependent brain-derived neurotrophic factor gene regulation and limbic epileptogenesis［J］.J Neurosci，2007，27(3):542 －52.

［5］ Yonekura I，Kawahara N，Nakatomi H，et al.A Model of global cerebral ischemia in C57 BL/6 mice［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2004，24(2):151 －8.

［6］ 姚瑞芹，張 麗，張 蘭，等.山茱萸環(huán)烯醚萜苷對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠BDNF及其受體TrkB表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(11):1535 －6.

［6］ Yao R Q，Zhang L，Zhang L，et al.Effect of cornel iridoid glycoside on expression of brain derived neurotrophic factor and its receptor-TrkB in focal cerebral ischemic rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11):1535 －6

［7］ Yao R Q，Zhang L，Wang W，et al.Cornel iridoid glycoside promotes neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function after focal cerebral ischemia in rats［J］.Brain Res Bull，2009，79(1):69 －76.

［8］ 楊 慧，關(guān)永源.星型膠質(zhì)細(xì)胞在腦缺血性疾病中的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(3):284 －6.

［8］ Yang H，Guan Y Y.Mechanisms of the neuroprotection of astrocyte during cerebral ischem ic disease［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):284－6.

［9］ 吳建華，謝立新，方 芳，等.法舒地爾可能通過(guò)PI3-K/Akt信號(hào)通路抑制大鼠腦缺血/再灌注區(qū)神經(jīng)元的凋亡［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2008，24(12):1568 －73.

［9］ Wu J H，Xie L X，F(xiàn)ang F，et al.Fasudil inhibits neuronal apoptosis after cerebral ischemia/reperfusion injury possibly through the PI3-K/Akt signal pathway［J］.Chin Pharmacol Bull，2008，24(12):1568－73

［10］Stocca G，Vicini S.Increased contribution of nr2a subunit to synaptic nmda receptors in developing rat cortical neurons［J］.J Physiol，1998，507(1):13 －24.

［11］Tovar K R，Westbrook G L.The incorporation of nmda receptors with a distinct subunit composition at nascent hippocampal synapses in vitro［J］.J Neurosci，1999，19(10):4180 －8.

［12］Hardingham G E，F(xiàn)ukunaga Y，Bading H.Extrasynaptic nmdars oppose synaptic nmdars by triggering creb shut-off and cell death pathways［J］.Nat Neurosci，2002，5(5):405 －14.

［13］Sattler R，Xiong Z，Lu W Y，et al.Distinct roles of synaptic and extrasynaptic nmda receptors in excitotoxicity［J］.J Neurosci，2000，20(1):22－33.

［14］尹艷艷，李衛(wèi)平，李維祖，等.黃芪總苷對(duì)大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后BDNF、TrkB和p75NTR mRNA表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(5):672 －6.

［14］Yin Y Y，Li W P，Li W Z，et al.Effects of astragalosides on the expression of BDNF，TrkB and p75NTR mRNA against focal cerebral ischemia/reperfusion injury［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(5):672－6.