苦參堿誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的機制研究

郭啟帥，黃 曦，李少林

(重慶醫(yī)科大學(xué)1.放射醫(yī)學(xué)教研室、2.附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科，重慶 400016)

苦參堿(matrine，Mat)是豆科槐屬植物中分離出來的一種生物堿，具有抗炎、抗病毒、抗心律失常和抗腫瘤等多種藥理作用［1－2］，可誘導(dǎo)白血病、肝癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡［3，5］，并且毒副作用較小。作為一種具有良好發(fā)展前景的抗腫瘤藥物，已受到研究者的廣泛關(guān)注，但苦參堿對卵巢癌細(xì)胞的影響及分子機制尚未見報道。為此，本實驗我們觀察Mat對卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡及對Survivin和Caspase-3表達的影響，探討其作用機制，為Mat用于臨床抗腫瘤治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌SKOV3細(xì)胞購于中科院上海生物細(xì)胞庫?？鄥A注射液購自遼寧玉皇藥業(yè)有限公司(批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 H20083501，產(chǎn)品批號:08091611，5 ml:50 mg);四氮甲基偶氮唑藍(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品;Annexinv-FITC/PI凋亡檢測試劑盒為上海碧云天公司產(chǎn)品;鼠抗人Survivin及Capase-3抗體購于Santa Cruz公司 ;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品;總RNA提取試劑盒為北京天根生物公司產(chǎn)品;RTPCR兩步法試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品;RPMI 1640為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清購自杭州四季清公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將卵巢癌SKOV3細(xì)胞置于含有100 mg·L－1胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)基，37℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中無菌培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達0.80～0.90時，以2.5 mg·L－1胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進行以下實驗。

1.2.2 MTT檢測細(xì)胞的增殖抑制率 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞，實驗前用臺盼藍拒染法確保細(xì)胞拒染率在0.97以上，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×107·L－1，取200 μl接種于96 孔板中(6 ×103/孔)，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，分別加入不同濃度Mat，使終濃度為0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L－1處理細(xì)胞，并設(shè)空白對照組。培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入5 g·L－1MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸去上清，每孔加入 DMSO 100 μl于振蕩器上振搖，待藍色晶體完全溶解后，在酶標(biāo)儀上測定570 nm處的吸光度值(OD值)，并按公式計算抑制率及IC50。抑制率/%=(1－實驗組OD值/空白對照組OD值)×100%。log IC50=Xm-I［P-(3-Pm-Pm)/4］，Xm=log最大劑量，I=log(最大劑量/相鄰劑量)，P=抑制率之和，Pm=最大抑制率，Pn=最小抑制率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的SKOV3細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(6×104/孔)，培養(yǎng)24 h后換含0.8、1.6 g·L－1Mat的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，并設(shè)空白對照組。共同培養(yǎng)48 h后消化，1 000×g離心5 min，棄上清，PBS洗2次，收集細(xì)胞，200 μl Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入 10 μl An nexinV-FITC和5 μl PI室溫避光孵育30 min，最后加入300 μl Binding Buffer，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Cell Quest軟件分析。

Tab 1 Inhibitory effect of Mat on SKOV3cells detected by MTT assay(±s，n=5)

Tab 1 Inhibitory effect of Mat on SKOV3cells detected by MTT assay(±s，n=5)

*P＜0.05 vs control group

Group OD Inhibitory rate/%24 h 48 h 72 h Control 0.8234 ±0.0146 1.1682 ±0.0382 1.4368 24 h 48 h 72 h±0.0429 － － －Mat 0.4 g·L －1 0.7865 ±0.0127 0.9651 ±0.0345* 1.0267 ±0.0327* 4.48 17.39 28.55 0.8 g·L －1 0.7326 ±0.0114* 0.8965 ±0.0312* 0.9685 ±0.0239* 11.03 23.25 32.59 1.2 g·L －1 0.6799 ±0.0113* 0.7338 ±0.0265* 0.8145 ±0.0218* 17.43 37.19 43.38 1.6 g·L －1 0.6164 ±0.0109* 0.5248 ±0.0238* 0.5038 ±0.0188* 25.14 55.08 64.98 2.0 g·L －1 0.5441 ±0.0098* 0.4646 ±0.0184* 0.4296 ±0.0134*33.02 60.23 70.04

1.2.4 RT-PCR檢測Survivin mRNA表達 設(shè)空白對照組及0.8、1.6 g·L－1Mat處理組。收集培養(yǎng)48 h后的各組細(xì)胞1×106個，提取細(xì)胞總RNA，取1 μl RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再cDNA為模板，進行 PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系 50 μl，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 min;94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸7 min。利用 Primer 5.0設(shè)計 Survivin引物:上游:5'-TTTTCATCGT CGTCCCTA-3'，下 游:5'-CCTTCCCAGACTCCACTC-3'，擴增片段長度為689 bp;內(nèi)參β-actin引物上游:5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3';下 游:5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'，擴增片段長 285 bp。2.0 g·L－1瓊脂糖凝膠上進行電泳，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片，結(jié)果采用Quantity one軟件進行灰度值分析，計算每組Survivin與β-actin的比值判斷Survivin mRNA的相對表達水平。按下列公式計算表達抑制率。Survivin基因表達抑制率/%=1－實驗組表達水平/空白對照組表達水平×100%。

1.2.5 Western blot檢測 Survivin及 Caspase-3 蛋白的表達 實驗分組同“1.2.4”。收獲處理48 h后的各組細(xì)胞，用RIPA液裂解提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取40 μg總蛋白選擇10%分離膠和5%濃縮膠進行SDS-PAGE電泳，完畢后將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后分別加1∶500稀釋的鼠抗人Survivin、Caspase-3多克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，再加1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG溫育2 h，TBST洗3次，用 BeyoECL Plus顯影。Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并進行密度分析，以表示Survivin和Caspase-3蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及兩個獨立樣本的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Mat對SKOV3細(xì)胞增殖的影響MTT法檢測顯示，在0.4～2.0 g·L－1濃度范圍內(nèi)的Mat對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有抑制作用，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見Tab 1);并且隨著Mat濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈時間和劑量依賴性。Mat作用SKOV3細(xì)胞 24、48、72 h 的 IC50為分別 3.38、1.57、1.13 g·L－1。

2.2 Mat對SKOV3細(xì)胞凋亡的作用經(jīng)0.8、1.6 g·L－1Mat處理48 h后，SKOV3細(xì)胞早期凋亡率分別為(11.44±0.56)%、(17.68±0.98)%，與空白對照組(4.85±0.31)%比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見Fig 1。提示Mat作用后，促進了卵巢癌細(xì)胞的凋亡。

2.3 Mat對SKOV3細(xì)胞Survivin mRNA表達的影響經(jīng)0.8、1.6 g·L－1Mat處理48 h后，SKOV3細(xì)胞中Survivin mRNA表達量明顯下調(diào)，與空白對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。Survivin mRNA表達抑制率分別為20.50%、38.83%，見Fig 2。

2.4 苦參堿對SKOV3細(xì)胞Survivin和Caspase-3蛋白表達的影響經(jīng)0.8、1.6 g·L－1Mat作用48 h后，采用Western blot檢測各組細(xì)胞中的Survivin和Caspase-3蛋白表達，可見各組細(xì)胞中內(nèi)參蛋白βactin條帶亮度相似，在16.5 ku位置均出現(xiàn)Survivin特異性蛋白條帶，但經(jīng)過Mat處理后，蛋白條帶明顯弱于空白對照組(P＜0.05)，蛋白表達抑制率分別為25.47%、41.84%;而Caspase-3蛋白在Mat處理后表達明顯增加(P＜0.05)。見Fig 3。

3 討論

Fig 1 The early stage apoptosis of SKOV3cells detected by flow cytometry

Fig 2 Expression of Survivin mRNA in SKOV3 cells measured by RT-PCR

Fig 3 Expression of Survivin and caspase-3 protein in different groups measured by Western blot

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，因發(fā)現(xiàn)時多處于中晚期，手術(shù)治療效果欠佳，化療是其主要治療手段。但由于抗腫瘤的化療藥物選擇性較差，毒副作用大，并易產(chǎn)生耐藥，在臨床應(yīng)用中受到限制。因此，尋求高效低毒的抗腫瘤藥是目前研究的方向。作為我國傳統(tǒng)中藥的Mat具有清熱解毒、保肝、抗病毒等多種藥理作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Mat也具有抗腫瘤作用。萬旭英等［6］研究顯示Mat可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞分化，逆轉(zhuǎn)其惡性表型。Mat可誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡，其作用機制與Bcl-2表達下調(diào)有關(guān)［7］。大量的體外研究也顯示Mat對多種腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，而且在抗腫瘤的同時，對正常細(xì)胞不產(chǎn)生破壞，并可提高機體免疫力。因此，Mat有望成為一種新型的抗腫瘤藥物。

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)0.4～2.0 g·L－1的Mat對卵巢癌SKOV3細(xì)胞均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加和作用時間的延長，Mat對SKOV3細(xì)胞的生長抑制作用逐漸增強，呈時間－劑量依賴性，24、48、72 h 的 IC50分別為 3.38、1.57、1.13 g·L－1。在實驗中我們選取0.5 IC50和IC50的Mat濃度0.8、1.6 g·L－1作為實驗濃度，以48 h作為實驗時間進行后續(xù)研究。

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性的死亡過程，是機體清除衰老、損傷和突變細(xì)胞的重要方式。目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞凋亡受抑是腫瘤發(fā)生的重要原因，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為現(xiàn)代抗腫瘤治療的新策略。細(xì)胞凋亡受機體促凋亡調(diào)節(jié)分子如Caspase家族和抑制凋亡調(diào)節(jié)分子如凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)等家族的調(diào)節(jié)。目前在人體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)Caspase家族共14種，其中起核心作用的是Caspase-3［8］。正常情況下細(xì)胞質(zhì)中的Caspase-3以無活性的procaspase-3形式存在，在多種凋亡信號刺激下經(jīng)蛋白水解作用將無活性的前體procaspase-3激活成活化的Caspase-3，從而引起細(xì)胞凋亡。因此，Caspase-3活性增加是細(xì)胞凋亡的重要機制。Survivin是IAP家族的一個新成員，為迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，主要分布于胚胎及分化未成熟的組織中，在分化成熟的組織一般不表達或低表達，但在多種腫瘤組織中呈高表達，且其表達程度與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［9－10］。研究顯示:Survivin具有抑制細(xì)胞凋亡，促進細(xì)胞轉(zhuǎn)化、參與細(xì)胞的有絲分裂、血管的生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生等作用。Survivin主要通過Caspase依賴和非依賴兩種途徑發(fā)揮抗凋亡作用。當(dāng) Survivin與 Caspase-3和Caspase-7結(jié)合后，抑制其活性，從而促進細(xì)胞凋亡［11］。

實驗中我們采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色行流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示Mat可誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞的凋亡率隨劑量增加而增多;RT-PCR及 Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，0.8、1.6 g·L－1濃度 Mat處理48 h后，SKOV3細(xì)胞中Survivin的mRNA和蛋白表達均明顯受抑，而Caspase-3蛋白表達增加(P＜0.05)。因此我們推測苦參堿可能通過下調(diào)Survivin的表達、增加Caspase-3的活性，從而誘導(dǎo)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡達到抑制腫瘤的作用。

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