ZX-5對(duì)一氧化氮合酶表達(dá)和活性的調(diào)節(jié)作用

魏 晉，潘 麗，張奕華，徐寒梅

(中國藥科大學(xué)1.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院、2.藥學(xué)院，江蘇南京 210009)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種常見的能夠?qū)е乱暳λト趸蛑旅さ睦夏晷匝劭萍膊?，僅美國就有1千萬患者，在中國人數(shù)更多，約5 000萬以上［1-2］。AMD的特征性表現(xiàn)是黃斑區(qū)出現(xiàn)玻璃疣，伴有脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)形成或地圖樣萎縮斑。在2/3以上的AMD患者中，CNV產(chǎn)生的主要原因是早期的脈絡(luò)膜循環(huán)障礙，要預(yù)防或阻止它的發(fā)生，必須改善和促進(jìn)脈絡(luò)膜血流［3-4］。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在AMD患者的脈絡(luò)膜血管和脈絡(luò)膜血管細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達(dá)有明顯的減少，而神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)無明顯變化［5］，這表明 eNOS 表達(dá)量和一氧化氮(NO)釋放量的減少是AMD的形成一個(gè)重要原因。研究表明NO是調(diào)控眼脈絡(luò)膜血流的一個(gè)重要因子，它能夠舒張血管平滑肌，增加血流，減少脈絡(luò)膜新生血管形成［3-5］，因此，NO調(diào)控劑在治療CNV形成和AMD疾病上有著重要的意義。

Fig 1 The chemical structure of ZX-5

本課題組張奕華教授設(shè)計(jì)合成了200多個(gè)NO調(diào)控劑，經(jīng)美國德州農(nóng)工大學(xué)(A＆M Univ.)醫(yī)學(xué)中心眼科研究所所長(zhǎng)邱春憶教授等篩選，發(fā)現(xiàn)其中的化合物(R，R)ZX-5(10 g·L-1)能明顯增加新西蘭白兔脈絡(luò)膜血流，但對(duì)其虹膜和睫狀體血流沒有影響。(R，R)ZX-5為順式-1-苯基-3-{3-甲氧基-2-丙氧基-5-［4-(3，4，5-三甲氧基苯基)-1，3-二氧戊環(huán)-2-基］苯基}硫脲。而且，該化合物的反式結(jié)構(gòu)，即(S，S)ZX-5卻不能夠促進(jìn)新西蘭白兔的脈絡(luò)膜血流［4］。這說明促進(jìn)脈絡(luò)膜血流是(R，R)ZX-5特有的功能。由于3種一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在眼部脈絡(luò)膜血管中都有表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)并沒有闡明ZX-5通過調(diào)控哪種NOS的酶活，發(fā)揮促進(jìn)脈絡(luò)膜血流的作用;因此，我們將通過體外研究闡明ZX-5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的3種NOS表達(dá)和活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料ZX-5由本課題組張奕華教授設(shè)計(jì)并合成，分子結(jié)構(gòu)見Fig 1;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)購自美國Sciencell Research Laboratories;NOS和βactin一抗購自美國Santa Cruz公司;二抗購自聯(lián)科生物分裝Multi Sciences;PVDF轉(zhuǎn)印膜購自美國Millipore公司;通用蛋白裂解試劑盒購自上海生物工程有限公司;Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海欣百諾生物科技有限公司;NOS活性檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物科技公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;X膠片、顯影液、定影液購自武漢博士徳生物工程有限公司;其它試劑均為分析純。752型紫外可見分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司，上海);VE-180垂直電泳儀(上海天能科技有限公司，上海);DYCZ-40D型蛋白轉(zhuǎn)移電泳儀(北京六一儀器廠，北京)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)液為Sciencell Research Laboratories專用內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)液，含有5%胎牛血清(FBS)、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGs)、青霉素和鏈霉素。用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞后，以3×105每孔接種到6孔板中，鋪板24 h后給藥(R，R)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)、(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)和DMSO作為陰性對(duì)照，每組6個(gè)重復(fù)。

1.3 蛋白抽提和蛋白定量給藥12 h后，棄去培養(yǎng)液用冰冷的PBS洗滌，再用含有1 mmol·L-1的0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞，用每孔60 μl通用蛋白裂解液在冰上裂解細(xì)胞。4℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清液備用。蛋白濃度測(cè)定:每孔取3 μl蛋白樣品，根據(jù)Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒的說明書要求測(cè)定蛋白含量。

1.4 Western blot分析NOS蛋白蛋白樣品加入上樣緩沖液后用10%的SDS-PAGE凝膠分離，而后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上;轉(zhuǎn)印膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h，經(jīng)過TBST洗膜后加入一抗，在4℃條件下孵育過夜;經(jīng)過TBST洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗，孵育4 h;TBST洗膜后用ECL試劑盒曝光檢測(cè)的NOS表達(dá)變化。

1.5 NOS活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè) NOS的活力NOS催化L-Arg和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，在530 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的大小可計(jì)算出NOS的活力。待測(cè)蛋白樣品分為總NOS活力測(cè)定組和NOS分型活力測(cè)定組，加入底物緩沖液，促進(jìn)劑，顯色液，其中NOS分型活力測(cè)定組加入相應(yīng)的抑制劑后37℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)15 min后加入透明劑和終止液終止反應(yīng)、混勻，在530 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管的吸光度值。用每毫克蛋白每分鐘生成1 nmol NO為一個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果

2.1 ZX-5上調(diào)iNOS蛋白表達(dá)量ZX-5能夠增加iNOS蛋白表達(dá)量，Western blot結(jié)果見Fig 2A。iNOS蛋白表達(dá)量變化用軟件對(duì)條帶比較分析，用iNOS/β-actin的比值表示，計(jì)算iNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見Fig 2B。結(jié)果顯示和陰性對(duì)照相比，(R，R)ZX-5和(S，S)ZX-5都能夠增加iNOS蛋白表達(dá)量，其中(R，R)ZX-5能少量的上調(diào)iNOS的表達(dá)(對(duì)應(yīng)給藥質(zhì)量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，iNOS 上調(diào)率3.4%、4.2%和 3.9%)，而(S，S)ZX-5 能夠比較明顯地上調(diào)iNOS表達(dá)(對(duì)應(yīng)給藥質(zhì)量濃度7.5、15和30 mg · L-1，iNOS 上調(diào)率2.8%、34.1% 和39.7%)。

Fig 2 AiNOS expression in ZX-5 induced HUVECsFig 2B Effects of ZX-5 on up-regulating iNOS expression

2.2 ZX-5不影響nNOS蛋白表達(dá)量ZX-5不影響nNOS蛋白表達(dá)量，Western blot結(jié)果見Fig 3A。nNOS蛋白表達(dá)量變化用軟件對(duì)條帶比較分析，用nNOS/β-actin的比值表示，計(jì)算nNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見Fig 3B。結(jié)果顯示和陰性對(duì)照相比，(R，R)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)和(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)都不能影響nNOS蛋白表達(dá)量。

Fig 3 AnNOS expression in ZX-5 induced HUVECs;Fig 3B Effects of ZX-5 on nNOS expression

Fig 4 AeNOS expression in ZX-5 induced HUVECs;Fig 4B Effects of ZX-5 on eNOS expression

2.3 (R，R)ZX-5上調(diào) eNOS蛋白表達(dá)量ZX-5這對(duì)異構(gòu)體對(duì)eNOS蛋白表達(dá)量的影響不同，Western blot結(jié)果見Fig 4A。eNOS蛋白表達(dá)量變化用軟件對(duì)條帶比較分析，用eNOS/β-actin的比值表示，計(jì)算eNOS蛋白相對(duì)表達(dá)水平，結(jié)果見Fig 4B。結(jié)果顯示和陰性對(duì)照相比，(S，S)ZX-5(7.5，15，30 mg·L-1)不能影響eNOS蛋白表達(dá)量，但是(R，R)ZX-5卻能夠增加eNOS蛋白表達(dá)量(對(duì)應(yīng)給藥的質(zhì)量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，eNOS 上調(diào)率 4.1%、17.9%和 16.7%)。

2.4 (S，S)ZX-5 上調(diào) iNOS 的活力(S，S)ZX-5能夠上調(diào)iNOS蛋白活力，iNOS酶活測(cè)定結(jié)果見Fig 5。iNOS的酶活變化用iNOS活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定，并根據(jù)試劑盒說明書表示酶活。和陰性對(duì)照相比，(S，S)ZX-5能夠增加iNOS酶活(對(duì)應(yīng)給藥的質(zhì)量濃度 7.5、15、30 mg·L-1，NO 產(chǎn)量的上調(diào)率 3.9%、12.9%和 24.9%);而(R，R)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)不能夠增加iNOS酶活，產(chǎn)生大量的NO。

Fig 5 Effects of ZX-5 on influencing iNOS activity in HUVECs(±s)

2.5 ZX-5不改變 nNOS酶活給藥 ZX-5后的nNOS的酶活變化用nNOS活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定，并根據(jù)試劑盒說明書的要求表示酶活。nNOS酶活測(cè)定結(jié)果見 Fig 6。和陰性對(duì)照相比，(R，R)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)和(S，S)ZX-5(7.5、15、30 mg·L-1)都不能夠改變nNOS酶活。

2.6 (R，R)ZX-5上調(diào) eNOS酶活(R，R)ZX-5能夠上調(diào)eNOS酶活，eNOS酶活測(cè)定結(jié)果見Fig 7。eNOS的酶活變化用eNOS活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定，并根據(jù)試劑盒說明書表示酶活。和陰性對(duì)照相比，(R，R)ZX-5能夠增加eNOS酶活(對(duì)應(yīng)給藥濃度7.5、15、30 mg·L-1，NO 產(chǎn)量的上調(diào)率 14.4%、22.7%和28.2%);而(S，S)ZX-5(給藥 7.5、15、30 mg·L-1)對(duì)eNOS酶活性影響不明顯。

3 討論

Fig 6 Effects of ZX-5 on changing nNOS activity in HUVECs

Fig 7 Effects of ZX-5 on changing eNOS activity in HUVECs

哺乳動(dòng)物體內(nèi)有3種NOS，它們盡管主要分布的組織不同，但是在血管內(nèi)皮細(xì)胞中都會(huì)表達(dá)［6-8］。在本次研究中，我們首先檢測(cè)了ZX-5對(duì)nNOS表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)ZX-5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的nNOS的表達(dá)和酶活都沒有明顯影響。nNOS釋放的NO主要發(fā)揮細(xì)胞間信號(hào)傳遞的功能，這表明ZX-5不會(huì)通過影響nNOS的酶活而增加NO釋放量，即該化合物不通過調(diào)控nNOS的酶活，增加脈絡(luò)膜血流。

iNOS在正常情況下很少表達(dá)，只有在機(jī)體發(fā)生病變時(shí)或者受到外界刺激時(shí)才會(huì)表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生NO;但是iNOS產(chǎn)生NO過程持續(xù)的時(shí)間比較久，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生危害［8-9］，例如在一系列眼部疾病中就有因iNOS表達(dá)而長(zhǎng)時(shí)間地產(chǎn)生NO的現(xiàn)象［3］。本研究發(fā)現(xiàn)(R，R)ZX-5和(S，S)ZX-5均能夠不同程度地上調(diào)iNOS表達(dá)，而僅僅(S，S)ZX-5能誘導(dǎo)iNOS產(chǎn)生少量NO。究其原因，可能ZX-5是小分子化合物，因而不會(huì)像病原體一樣能夠激活iNOS產(chǎn)生大量的NO。不過，盡管(S，S)ZX-5能夠通過激活iNOS產(chǎn)生少量的NO，但由于iNOS一旦誘導(dǎo)就會(huì)較長(zhǎng)時(shí)間的釋放NO，而對(duì)眼部產(chǎn)生一定危害，所以(S，S)ZX-5不具有開發(fā)出來治療AMD的潛力。

和iNOS不同，eNOS在正常情況下也在脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，通過調(diào)控NO的釋放，發(fā)揮調(diào)控血管舒張和血流的功能;而且該酶在受到外界刺激信號(hào)時(shí)，也會(huì)在短時(shí)間地釋放NO，產(chǎn)生特定生理功能［4，10］。本研究發(fā)現(xiàn)(S，S)ZX-5 不影響 eNOS 的酶活和NO的釋放，但(R，R)ZX-5能夠上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)和酶活，增加NO的釋放，這說明(S，S)ZX-5和(R，R)ZX-5的立體結(jié)構(gòu)差異對(duì)eNOS的調(diào)控有著巨大的區(qū)別。eNOS活性受到包括乙酰化、蛋白相互作用、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、蛋白質(zhì)的磷酸化等等在內(nèi)的復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控［11］。為了闡明(R，R)ZX-5通過哪些途徑調(diào)節(jié)eNOS的活性，我們正在進(jìn)行相關(guān)的研究。

本研究結(jié)果表明，盡管在內(nèi)皮細(xì)胞中3種NOS都會(huì)表達(dá)，但是(S，S)ZX-5能通過上調(diào)iNOS表達(dá)和酶活較長(zhǎng)時(shí)間地釋放NO，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不良的影響。(R，R)ZX-5卻能夠通過上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中的eNOS蛋白表達(dá)和酶活，增加NO釋放量，促進(jìn)脈絡(luò)膜血流，從而發(fā)揮預(yù)防和治療AMD眼病的作用。

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