丹參素異丙酯對(duì)離體大鼠缺血/再灌注損傷心肌的影響

程亮星，岳云宵，王世祥，南葉飛，鄭曉暉，戚 敏，于 爽，付潤(rùn)芳

(1.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，河南鄭州 450052;2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MIRI)就是心肌在恢復(fù)血流以后即心肌得到血液再灌注后，不僅功能未得到恢復(fù)，反而使心肌損傷加重，出現(xiàn)心律失常、梗死面積擴(kuò)大等［1］。其機(jī)制主要有:鈣超載、氧自由基和活化的中性粒細(xì)胞的作用及急性炎癥反應(yīng)等［2－3］。因此，如何防止鈣超載、抗氧化、清除自由基、改善細(xì)胞能量代謝、調(diào)動(dòng)內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制等［4］，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。有關(guān)報(bào)道［5］表明復(fù)方丹參滴丸(CDDP)具有抗MIRI作用。丹參素異丙酯(IDHP)是由本課題組前期采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)復(fù)方丹參方研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的一種體內(nèi)代謝物［6］，其是否也具有相同的作用尚未有人研究。本研究采用Langendorff灌流技術(shù)制備離體大鼠MIRI模型，探討IDHP對(duì)大鼠MIRI的影響，擬從能量代謝及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)兩個(gè)角度探討IDHP對(duì)其影響機(jī)制，以期為臨床治療MIRI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品與試劑 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)及一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)3種物質(zhì)的鈉鹽均購(gòu)自Amresco公司，批號(hào)分別為:0220、0160、0634;IDHP由西北大學(xué)中草藥現(xiàn)代化研究及工程中心提供，批號(hào):2006－2;CDDP購(gòu)自天津天士力制藥股份有限公司，批號(hào):20061008;其他試劑均為國(guó)內(nèi)分析純。

1.1.2 主要儀器 Langendorff灌流裝置(自制);日本島津LC-6A型高效液相色譜儀、SPD-6A型紫外檢測(cè)器，日本島津公司產(chǎn)品;Scienhome C18色譜柱(250 nm×4.6 nm，5 μm)，江蘇淮安市恒天公貿(mào)有限公司產(chǎn)品;H－7500透射電鏡，日本日立公司產(chǎn)品。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠，體質(zhì)量290～320 g，♀♂不限，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(豫)2005－0001。

1.2 方法

1.2.1 大鼠離體心臟灌流模型的建立［7］各組大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的戊巴比妥鈉(0.4 μl·g－1)腹腔注射麻醉，同時(shí)腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的肝素鈉(0.2 μl·g－1);常規(guī)開(kāi)胸取出心臟，放入盛有 0 ～4℃預(yù)冷灌流液的平皿內(nèi)，用預(yù)冷灌流液沖掉殘留血液，迅速連接到Langendorff灌流裝置上開(kāi)始灌流。灌流壓為88 kPa;灌流液為Krebs-Hanseleit磷酸緩沖液，其組成為(mmol·L－1):NaCl 118.0，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，KH2PO41.2，NaHCO325.0，CaCl222.5，Glucose 11.0，pH 7.4，滲透壓 300 mOsm·L－1;灌流前以體積分?jǐn)?shù)95%O2+體積分?jǐn)?shù)5%CO2混合氣平衡15 min，灌流中持續(xù)通氣;在灌流過(guò)程中，保持灌流液在37℃。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥方法 80只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥(CDDP 50.00 mg·L－1)前保護(hù)及后保護(hù)組、IDHP 4.00 mg·L－1和0.04 mg·L－1兩個(gè)劑量的前保護(hù)及后保護(hù)組，共8組，每組10只?？瞻讓?duì)照組:持續(xù)灌流75 min;模型組:預(yù)灌15 min，37℃條件下停灌40 min，復(fù)灌20 min;各用藥組:分別在預(yù)灌或復(fù)灌時(shí)加入相應(yīng)的藥物，濃度分別為 50.00、50.00、4.00、4.00、0.04、0.04 mg·L－1，其他處理同模型組。

1.2.3 心肌高能磷酸化合物(high energy phosphates，HEP)含量測(cè)定 灌流結(jié)束后，剪取左心室，立即用液氮預(yù)冷的金屬夾板夾成冰凍薄片，放入液氮中待測(cè)。每例心肌標(biāo)本稱(chēng)取100 mg，加入預(yù)冷的0.42 mol·L－1高氯酸制成勻漿;加入 1.00 mol·L－1氫氧化鉀中和;超聲波細(xì)胞粉碎器將線粒體膜粉碎，使能量物質(zhì)全部釋放于溶液中;以上操作過(guò)程均在冰水中進(jìn)行。4℃、15 000 r·min－1離心15 min;取上清液用0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾;吸取20 μl濾液上柱分析以測(cè)定能量物質(zhì)變化，色譜條件:流動(dòng)相為215 mmol·L－1KH2PO4與3.5%乙腈組成，三乙胺調(diào)pH值至6.1，流速為0.5 ml·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30℃。

1.2.4 心肌超微結(jié)構(gòu)的觀察 灌流結(jié)束后，在0℃～4℃的4%戊二醛－磷酸緩沖液中，從心臟左室游離壁處剪取1 mm×1 mm×3 mm的小塊，放入預(yù)冷的4%戊二醛－磷酸緩沖液中，4℃固定8 h，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片、染色后在電鏡下觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用±s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，組間用LSD法進(jìn)行兩兩比較;不適合方差分析者，用Mann-Whitney U法進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 HEP含量與空白對(duì)照組相比，模型組的ATP、ADP、AMP及腺嘌呤核苷酸總量(total adenine nucleotides，TAN)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);與模型組相比，各用藥組的ADP、AMP及TAN明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);與模型組相比，CDDP 50.0 mg·L－1前保護(hù)和后保護(hù)組、IDHP 4.00 mg·L－1前保護(hù)和后保護(hù)組的ATP含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);IDHP 0.04 mg·L－1前保護(hù)和后保護(hù)組的ATP含量與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn) Tab 1。

2.2 心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果空白對(duì)照組心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，心肌細(xì)胞核膜和線粒體膜完整，染色質(zhì)均勻、細(xì)密，線粒體基質(zhì)致密，嵴排列緊密整齊，線粒體和糖原顆粒豐富，見(jiàn)Fig 1;模型組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，心肌細(xì)胞有少量輕度壞死區(qū)肌節(jié)排列紊亂或消失，核的一端基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，線粒體和糖原數(shù)量明顯減少，見(jiàn)Fig 2;CDDP 50.00 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組及 IDHP 4.00 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組超微結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相似，損傷較輕，見(jiàn) Fig 3～6;與模型組相比，IDHP 0.04 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷有所改善，但仍較嚴(yán)重，見(jiàn)Fig 7、8。

3 討論

心臟是一個(gè)高度需氧和耗能的器官，其能量主要來(lái)源于脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化產(chǎn)生的ATP，ATP等能量物質(zhì)的充分供應(yīng)是維持心肌細(xì)胞正常功能和完整結(jié)構(gòu)的保證。因此，當(dāng)心肌缺血時(shí)，恢復(fù)血流成了首要任務(wù)，然而恢復(fù)血流后通常會(huì)出現(xiàn)損傷加重的現(xiàn)象，即MIRI，這也是一些心臟手術(shù)治療常見(jiàn)的并發(fā)癥。如何解決MIRI也成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。近年來(lái)有學(xué)者提出心肌能量代謝障礙是MIRI的始動(dòng)因子［8］。心肌缺血后，脂肪酸和葡萄糖的有氧氧化受阻，靠糖的無(wú)氧酵解來(lái)提供ATP，但是無(wú)氧糖酵解產(chǎn)生ATP的能力只有有氧氧化的1/18，造成心肌細(xì)胞內(nèi)ATP的迅速耗竭。ATP水平的降低將導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝紊亂、功能低下，進(jìn)而通過(guò)不同途徑引起組織結(jié)構(gòu)和功能的損害［9，10］。例如，糖酵解的加速為心肌提供一定ATP的同時(shí)也使組織間液和細(xì)胞內(nèi)的pH值明顯降低，再灌注后組織間液的H+濃度迅速下降，而細(xì)胞內(nèi)的H+濃度仍然很高，這時(shí)，細(xì)胞膜兩側(cè)的H+濃度差可激活Na+/H+和Na+/Ca2+交換蛋白，促進(jìn)Ca2+內(nèi)流，加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載，造成線粒體等功能和結(jié)構(gòu)方面的損傷，進(jìn)而引起心肌的缺血/再灌注損傷［11］;另外，由于 ATP不能及時(shí)合成，心肌需要的能量將由ATP以ATP、ADP、AMP、腺苷、次黃嘌呤(IMP)的順序降解的方式來(lái)提供。這將會(huì)造成心肌 ATP、ADP、AMP及TAN含量的減少。

Tab 1 the effects of IDHP on the content of HEP in myocardium with ischemia/reperfusion in rats(±s，n=7)

Tab 1 the effects of IDHP on the content of HEP in myocardium with ischemia/reperfusion in rats(±s，n=7)

△△P ＜0.01 vs normal group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

Group ATP mg/100 g ADP mg/100 g AMP mg/100 g TAN mg/100 g Control 22.71 ±5.31 92.00 ±37.14 112.71 ±19.01227.43 ±36.43 Model 7.13 ±1.96△△ 5.24 ±1.72△△ 14.43 ±6.59△△ 27.90 ±7.53△△Pre-CDDP 50.00 mg·L－1 15.64 ±6.38* 48.41 ±16.31＊＊ 74.63 ±22.38＊＊ 138.69 ±42.72＊＊Post-CDDP 50.00 mg·L－1 12.90 ±5.91* 46.79 ±19.34＊＊ 71.53 ±36.23＊＊ 131.21 ±56.84＊＊Pre-IDHP 4.00 mg·L－1 12.30 ±6.27* 32.53 ±12.20＊＊ 73.53 ±34.41＊＊ 118.36 ±49.06＊＊Post-IDHP 4.00 mg·L－1 13.43 ±5.10* 49.07 ±30.68＊＊ 74.67 ±33.96＊＊ 137.17 ±63.21＊＊Pre-IDHP 0.04 mg·L－1 11.33 ±5.15 23.53 ±9.56* 35.11 ±11.72＊＊ 69.97 ±13.85＊＊Post-IDHP 0.04 mg·L－1 10.81 ±5.96 22.53 ±10.95＊＊ 40.27 ±23.85＊＊ 73.61 ±30.62＊＊

Fig 1 The ultrastructure of myocardium in the control group A:×5 000;B:×20 000 Fig 2 The ultrastructure of myocardium in the MIRI group A:×8 000;B:×20 000 Fig 3 The ultrastructure of myocardium in the Pre-CDDP(50.00 mg·L－1)group A:×7 000;B:×20 000 Fig 4 The ultrastructure of myocardium in the Post-CDDP(50.00 mg·L－1)group A:×6 000;B:×20 000 Fig 5 The ultrastructure of myocardium in the Pre-IDHP(4.00 mg·L－1)group A:×4 000;B:×20 000 Fig 6 The ultrastructure of myocardium in the Post-IDHP(4.00 mg·L－1)group A:×6 000;B:×20 000 Fig 7 The ultrastructure of myocardium in the Pre-IDHP(0.04 mg·L－1)group A:×5 000;B:×20 000 Fig 8 The ultrastructure of myocardium in the Post-IDHP(0.04 mg·L－1)A:×6 000;B:×20 000

線粒體是進(jìn)行細(xì)胞呼吸和氧化磷酸化反應(yīng)生成ATP的重要亞細(xì)胞單位［12］，是能量代謝的重要器官，它可直接利用葡萄糖、游離脂肪酸及酮體作為燃料，經(jīng)氧化磷酸化產(chǎn)生ATP［13］，其結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)直接決定ATP的生成。當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)、功能出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，氧化磷酸化功能受損，ATP生成減少。因而心肌線粒體的損傷程度也能反映MIRI程度。

本研究結(jié)果顯示:空白對(duì)照組心肌ATP、ADP、AMP含量及TAN是各組中最高的，且心肌肌原纖維排列整齊，明暗帶清晰，心肌細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)均勻、細(xì)密，線粒體基質(zhì)致密，嵴排列緊密，糖原顆粒豐富，表明其心肌無(wú)損傷，能量代謝正常;模型組的ATP、ADP、AMP及TAN含量與空白對(duì)照組相比顯著降低，且心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重，心肌細(xì)胞有輕度少量壞死區(qū)肌節(jié)排列紊亂或消失，核的一端基質(zhì)明顯水腫，線粒體大部分或全部的嵴和膜融合或消失，線粒體和糖原數(shù)量明顯減少，表明缺血/再灌注損傷造成了心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)破壞，影響了線粒體的正常功能，使其合成ATP能力下降，造成心肌能量代謝障礙。與模型組相比，各用藥組的ADP、AMP 及 TAN 升高，CDDP 50.0 mg·L－1前保護(hù)和后保護(hù)組、IDHP 4.00 mg·L－1前保護(hù)和后保護(hù)組的ATP含量亦升高;CDDP 50.00 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組及IDHP 4.00 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組超微結(jié)構(gòu)與空白對(duì)照組相似，損傷較輕;IDHP 0.04 mg·L－1前保護(hù)、后保護(hù)組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷與模型組相比有所改善，但損傷仍較嚴(yán)重。

結(jié)果提示，IDHP能夠減輕心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷，改善心肌能量代謝，且這種作用隨劑量的增加而加強(qiáng)，這可能與其能夠擴(kuò)張血管有關(guān)［14］，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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