脊髓腺苷受體介導側(cè)腦室嗎啡預處理對大鼠缺血后心肌的保護作用

梅 斌，張 野，陸 姚，程新琦，左友梅，李 銳，高 杉，陳志武

(安徽醫(yī)科大學1.第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230601;2.第一附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230022;3.藥理學教研室，安徽合肥 230032)

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射嗎啡可以減輕大鼠心肌的缺血/再灌注損傷，且多種內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)介導了這一作用［1-2］。大量研究證實［3］心肌腺苷受體和阿片受體的激動都可以有效地減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，并且二者存在著協(xié)同作用。已有學者發(fā)現(xiàn)［4］側(cè)腦室注射嗎啡可以促進脊髓水平的腺苷釋放，但是存在于脊髓背角神經(jīng)元的腺苷受體在中樞嗎啡預處理所產(chǎn)生的心肌保護效應中的作用尚不清楚。因此本研究的主要目的是探討脊髓腺苷受體是否介導了側(cè)腦室嗎啡預處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用，以及這一介導作用與心肌缺血/再灌注損傷所引起的炎癥反應的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物模型

1.1.1 鞘內(nèi)和側(cè)腦室內(nèi)置管動物模型的建立［5-6］選擇250～300 g♂SD大鼠，5%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1，ip。參照文獻方法，頸部沿脊柱切開皮膚2 cm，分離組織肌肉，暴露寰枕膜，向尾端將PE-10導管置入蛛網(wǎng)膜下腔約4 cm，固定導管，縫合傷口。鞘內(nèi)置管完成后，將大鼠固定在腦立體定位儀(藍星B型，淮北振華生物科技有限公司)上，暴露顱骨，根據(jù)Paxinos-Watson圖譜定位側(cè)腦室置管位置(坐標:P 1.5 mm，R 1.5 mm，H 3.0 mm)，用大鼠顱骨鉆鉆孔，將內(nèi)徑0.36 mm、外徑0.71 mm導管插入側(cè)腦室，腦脊液流出后，插入內(nèi)芯，用502膠混合牙托粉固定在顱骨上，以備側(cè)腦室給藥用，術(shù)后肌注青霉素10萬U，手術(shù)后動物均分籠單獨飼養(yǎng)3 d以備實驗。有感覺或運動障礙大鼠棄去。

1.1.2 心臟缺血/再灌注損傷模型的建立［1-2］所有成功鞘內(nèi)和側(cè)腦室置管的大鼠，5%戊巴比妥鈉40 mg·kg-1，ip。麻醉后氣管切開、插管后連接動物呼吸機(HX-300型成都泰盟生物科技有限公司)行機械通氣，潮氣量2～4 ml·kg-1，頻率70～80次。右股動脈切開置管，接壓力換能器，連接Power-Lab Systems(AD公司，澳大利亞)，記錄心電圖(ECG)、血壓(BP)﹑平均動脈壓(MAP)和心率(HR);右股靜脈切開置管用于輸液。沿左鎖骨中線切開皮膚2 cm，在左4～5肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右側(cè)心腔，擠出心臟。在動脈圓錐與左心耳之間結(jié)扎左冠狀動脈，方法是用6-0 Prolene線作一線結(jié)，把心臟放回胸腔。穩(wěn)定15 min后，收緊線結(jié)即形成左冠狀動脈閉塞致心肌缺血，表現(xiàn)為局部心肌發(fā)紺﹑血壓下降，ECG呈心肌梗死改變(ST段抬高或降低等);松開線結(jié)即可實現(xiàn)再灌注。平均動脈壓低于30 mmHg或出現(xiàn)頑固性室性心律失常的大鼠棄去不用。實驗結(jié)束后，暴露大鼠脊髓，并且側(cè)腦室內(nèi)注射亞甲藍1 μl，確定鞘內(nèi)和側(cè)腦室置管的準確性和有無損傷。

1.2 藥品和試劑嗎啡(批號090602-2，沈陽第一制藥廠)，茶堿(批號118K0890，Sigma公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司，使用濃度為100 mmol·L-1，磷酸鹽緩沖液 pH 7.4，溶解)，兔抗大鼠ICAM-1多克隆抗體(北京博奧森公司)，S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。

1.3 實驗方法成功建立動物模型的54只♂SD大鼠，隨機5組，除茶堿自身對照組(6只)外，其他每組12只。①假手術(shù)組(Sham組)，大鼠開胸后左冠狀動脈僅穿線不結(jié)扎，也不給與任何處理;②對照組(CON組):缺血30 min/再灌注120 min前，側(cè)腦室內(nèi)微量泵(史密斯公司，英國)恒速注射0.9%生理鹽水5 μl 5 min，停止注射5 min，重復3次，共計15 μl;③ 嗎啡預處理組(MPC組):在缺血30 min/再灌注120 min前，側(cè)腦室內(nèi)微量泵恒速注射嗎啡(1 μg·kg-1，用生理鹽水稀釋到 5 μl)5 min，停止5 min，重復3次，共計15 μl。④ 腺苷受體阻斷劑茶堿+嗎啡預處理組(MPC+THE組):在側(cè)腦室注射嗎啡前15 min一次性鞘內(nèi)注射茶堿10 μl(質(zhì)量濃度為5×103mg·L-1);⑤茶堿自身對照組(THE組):在側(cè)腦室注射0.9%生理鹽水前15 min一次性鞘內(nèi)注射茶堿10 μl(質(zhì)量濃度為5×103mg·L-1)。

1.4 觀察指標

1.4.1 血流動力學指標測定 通過PowerLab Systems連續(xù)記錄心電圖(ECG)、動脈血壓(BP)和心率(HR)。比較各組手術(shù)穩(wěn)定后15 min(基礎(chǔ)值)、缺血前、缺血30 min后和再灌注120 min后平均動脈壓(MBP)和心率(HR)，計算平均動脈壓和心率乘積(RPP)。

1.4.2 心肌梗死面積測定 在再灌注120 min時，取出心臟，剔除非心臟組織。生理鹽水灌注，沖洗出血液，結(jié)扎左冠狀動脈，從主動脈注入0.25%Evan blue dye溶液。置-80℃冰箱備用。將速凍后的心臟從心尖到心基部平行切5～6片，2 mm厚的心肌片，置1%氯化三苯基四氮唑 (TTC)溶液中，在37℃(pH 7.4)溫孵 15 min，染色，后置 10%福爾馬林固定，缺血危險區(qū)為紅色，梗死區(qū)為白色，在圖像分析軟件(Sigma Scan Program 4)下計算出左、右心室(LV，RV)、缺血危險區(qū)(AAR)和梗死區(qū)(IS)的面積，用面積乘以2 mm即為各自的體積，心肌梗死區(qū)面積以IS/AAR來表示。

1.4.3 免疫組化測定心肌ICAM-1 在再灌注120 min時，快速取出心臟，從心尖部剪下一塊心肌組織，放入10%福爾馬林中浸泡。常規(guī)包埋心肌標本，用切片機連續(xù)切成4 μm厚的冠狀切片、脫臘，ICAM-1一抗按1∶150稀釋，并按S-P法進行免疫組化染色，同時設(shè)陰性對照(用PBS替代一抗)，在倒置相顯微鏡(Olympus，Japan，×400)下拍取圖像。用Image-pro plus 6.0版圖像分析軟件進行圖像分析測定平均光密度(average optical density，AOD)。

1.5 統(tǒng)計學處理采用Prism 5.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls分析。

2 結(jié)果

2.1 血流動力學指標Sham組的 HR、MAP和RPP在各時點比較均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與CON組比較(Sham組除外)，各組HR、MAP和RPP在基礎(chǔ)值，缺血前，缺血30 min和再灌注120 min時比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。但與同組基礎(chǔ)值比較，各組HR、MAP和RPP在缺血30 min和再灌注120 min時都有降低(P＜0.05)。Tab 1。

2.2 心肌形態(tài)學指標各組LV+RV和AAR體積差異無顯著性(P＞0.05)。在IS和IS/AAR方面，MPC組與CON組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明側(cè)腦室注射嗎啡預處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用。MPC+THE組與MPC組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，同時，MPC+THE組與CON組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，表明鞘內(nèi)注射茶堿部分阻斷了側(cè)腦室注射嗎啡預處理對心肌缺血/再灌注損傷有保護作用。THE自身對照組與CON組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，說明鞘內(nèi)注射茶堿對IS以及IS/AAR沒有影響，Tab 2。

Tab 1 Hemodynamic parameters(±s，n=6)

Tab 1 Hemodynamic parameters(±s，n=6)

HR:heart rate(bpm);MAP:mean arterial pressure(mmHg);RPP:rate pressure product(mmHg·min-1/1 000)

Group Baseline Treatment 30-min occlusion 2-hour reperfusion HR MAP RPP SHAM 396±22 98±9 39±6 381±17 106±15 38±4 377±2 HR MAP RPP HR MAP RPP HR MAP RPP 5 77±10 34±8 384±16 80±13 37±6 CON 399±29 106±8 37±4 394±21 110±11 35±6 352±26 84±4 28±3 325±17 96±10 30±4 MPC 439±13 99±12 43±6 376±16 97±9 39±5 343±15 69±9 25±4 317±19 85±13 26±7 MPC+THE 413±26 112±9 41±3 380±15 99±16 35±7 346±13 82±3 26±1 326±20 88±5 27±3 THE 406±20 108±15 40±4 384±11 107±17 37±5 344±2 83±6 27±3 323±20 85±7 24±3

Tab 2 The changes of morphometrics( ± s，n=6)

Tab 2 The changes of morphometrics( ± s，n=6)

LV:left ventricle volume;RV:right ventricle volume;IS:infarct size;AAR:area at risk ＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs MPC

Group LV+RV volume/cm3 IS/AAR/%CON 0.92 ±0.11 0.44 ±0.02 0.22 ±0.02 51.2 ±3.3 ARR volume/cm3 IS volume/cm3 MPC 0.92 ±0.08 0.47 ±0.04 0.13 ±0.01＊＊ 28.1 ±2.5＊＊MPC+THE 0.91 ±0.04 0.45 ±0.04 0.19 ±0.01＊＊##44.0 ±2.0＊＊##THE 0.92 ±0.09 0.44 ±0.04 0.23 ±0.02 52.8 ±3.0

2.3 心肌組織的ICAM-1表達水平與Sham組相比，CON組心肌中的ICAM-1的表達明顯增多(P＜0.01);相對CON組而言，MPC組心肌中的ICAM-1的表達明顯減少(P＜0.01);而THE+MPC組心肌中的ICAM-1的表達水平較MPC組而言，明顯增多(P ＜0.01)，卻明顯低于 CON 組(P ＜0.01)，F(xiàn)ig 1，2。

Fig 1 Expression of ICAM-1 in the myocardial(×400)

Fig 2 The average optical density(AOD)of ICAM-1 in myocardial( ± s，n=6)

3 討論

我們前期研究發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室注射小劑量嗎啡可以減少大鼠心肌缺血/再灌注損傷的梗死區(qū)面積，與痛覺相關(guān)的物質(zhì)在其中起到關(guān)鍵作用，如P物質(zhì)(substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)、β-內(nèi)啡肽等［1，7］。

早在1989年DeLander等［8］就提出脊髓的腺苷及其受體參與了側(cè)腦室注射嗎啡的外周鎮(zhèn)痛作用。Sweeney等［4］通過測定脊髓腺苷水平以及鞘內(nèi)注射茶堿發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室注射嗎啡可以促進大鼠脊髓水平腺苷的釋放，從而活化存在于脊髓背角的腺苷受體，產(chǎn)生外周的鎮(zhèn)痛效應。本研究同樣通過在側(cè)腦室嗎啡預處理前鞘內(nèi)注射茶堿，發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室嗎啡預處理的心肌保護作用被明顯削弱，而僅僅鞘內(nèi)注射茶堿而不進行側(cè)腦室嗎啡預處理與對照組相比對心肌梗死面積沒有影響，這說明存在脊髓的腺苷受體不但介導了側(cè)腦室注射嗎啡的外周鎮(zhèn)痛作用，還參與了側(cè)腦室嗎啡預處理的心肌保護作用，而鞘內(nèi)注射茶堿本身對心肌缺血/再灌注損傷并沒有任何作用。

痛覺的產(chǎn)生是炎癥反應的重要體現(xiàn)，而在心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應的病理生理學過程中，中性粒細胞黏附一直被認為是加重損傷的重要因素［9］。本研究所測定的ICAM-1是反映中性粒細胞粘附的良好指標［10］。Bong 等［11］發(fā)現(xiàn)脊髓腺苷 A1受體的激動可以抑制脊髓的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體，通過上調(diào)外周炎癥反應部位的腺苷水平減輕炎癥反應。但也有研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角的各種腺苷受體亞型的激動都可以減輕外周炎癥反應所致的痛覺過敏，只是產(chǎn)生作用的時相不同［12］。為了闡明脊髓腺苷受體介導側(cè)腦室嗎啡預處理的心肌保護作用的可能機制，我們通過測定大鼠心肌ICAM-1水平發(fā)現(xiàn)，側(cè)腦室嗎啡預處理可以明顯的減輕心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應，而事先鞘內(nèi)注射腺苷受體阻斷劑卻明顯減輕這一作用，說明脊髓腺苷受體的介導作用可能是通過減輕心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應實現(xiàn)的。不足的是，我們沒有對腺苷受體的各個亞型進行深入的探討，在以后的工作中我們將繼續(xù)進行這方面的研究。

在本次研究中，我們同樣發(fā)現(xiàn)側(cè)腦室嗎啡預處理之前鞘內(nèi)注射腺苷受體阻斷劑并不能完全消除側(cè)腦室嗎啡預處理所發(fā)揮的心肌保護作用。相關(guān)的中樞嗎啡和腺苷對內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用的研究可以間接地解釋這一現(xiàn)象:鞘內(nèi)注射腺苷類似物可以減少腦脊液中SP的水平，但是CGRP的水平?jīng)]有改變，而脊髓中內(nèi)源性的阿片物質(zhì)不光調(diào)節(jié)了SP的水平，CGRP的水平也發(fā)生了變化［13-14］。我們已經(jīng)證實CGRP水平與心肌缺血/再灌注損傷呈負相關(guān)［1］。

綜上所述，側(cè)腦室嗎啡預處理可能通過促進脊髓腺苷的釋放而上調(diào)大鼠脊髓腺苷受體的激動水平，后者通過抑制心肌缺血/再灌注損傷的炎癥反應部分介導了側(cè)腦室嗎啡預處理對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用。

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