人參皂苷Rgl對慢性嗎啡作用及納洛酮催促戒斷SK-N-SH細(xì)胞的影響及機制研究

閆玉仙，宋月英，王小平，陳海生，文春曉

(1.武警醫(yī)學(xué)院實驗管理中心，天津 300162;2.武警8630醫(yī)院，天津 300250)

吸毒已成為全球性公害之一，由此引發(fā)的公共衛(wèi)生和社會安全問題日益嚴(yán)重，對吸毒人員的治療已成為亟待解決的醫(yī)學(xué)問題，也具有重要的現(xiàn)實意義。目前治療阿片類藥物成癮的方法主要有弱阿片類受體激動劑替代治療和非阿片類藥物對癥治療。替代治療不能解決替代藥物潛在的成癮性，不是真正意義上的治療;對癥治療方法是應(yīng)用抗焦慮藥、抗抑郁藥、弛緩藥等進(jìn)行針對戒斷癥狀的治療，這些藥物又都有長期的副作用。因此，尋找安全有效、能迅速脫毒到完全康復(fù)的藥物已成當(dāng)務(wù)之急。中醫(yī)中藥是我國重要的資源寶庫，中醫(yī)藥戒毒有悠久的歷史，并且，中藥藥理學(xué)已越來越多地在戒毒中發(fā)揮作用，對中醫(yī)藥戒毒具有極大的推動和促進(jìn)作用［1］。

三七為五加科植物，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有復(fù)雜的藥理作用，人參皂苷Rgl是三七的主要成分之一。研究表明［2］，人參皂苷類成分在整體動物行為學(xué)實驗中對嗎啡的成癮性具有明顯的拮抗作用，實驗室前期的研究也已證實:三七總皂苷(PNS)可以有效地緩解嗎啡成癮大鼠納洛酮催促戒斷癥狀［3］。為進(jìn)一步證實Rgl在嗎啡成癮及戒斷中的作用及機制，本研究采用SK-N-SH細(xì)胞為研究靶細(xì)胞，從細(xì)胞增殖、細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i、CaMKⅡβ mRNA 及蛋白表達(dá)等方面進(jìn)行了系列研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑SK-N-SH細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心;Rg1:(中國藥品生物制品鑒定所，編號110703);MTT、瓊脂糖(美國Sigma公司);鹽酸嗎啡購自沈陽第一制藥廠(批號20030928);Fura-2/AM(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司);鹽酸納洛酮(批號:03H1012，購自美國Sigma公司);優(yōu)質(zhì)胎牛血清(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司，批號:2008年2月);TRIzol、焦碳酸二乙酯(DEP)購自美國 Invitrogen公司;KOD-Plus-DNA多聚酶(日本TOYOBO公司);TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒(天根生化科技有限公司);化學(xué)發(fā)光試劑(美國Pierce公司);CaMKⅡβ抗體(美國Santa Cruz公司);引物由上海生工生物公司合成。

1.2 主要儀器RF-5301PC雙波長熒光分光光度計(日本島津公司);MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO);Nikon-TE300/TH-L熒光倒置顯微鏡(日本Nikon);Tecan-SUNRISE全波長酶標(biāo)儀(瑞士);濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜槽、電泳儀(美國BIO-RAD公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)SK-N-SH細(xì)胞株培養(yǎng)于含0.012 mol·L－1胎牛血清、0.1 U·L－1青霉素及 0.1 g·L－1鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中。孵育箱內(nèi)含5%CO2，恒溫37℃，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期進(jìn)行傳代。

1.4 MTT法檢測SK-N-SH細(xì)胞的活性對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×105密度接種于96孔板，實驗分為:生理鹽水對照組(NS);嗎啡組(MOR);1、2、4、8、16、32 μmol·L－1Rg1 預(yù)處理組;每組8 孔。培養(yǎng)24 h使細(xì)胞同步進(jìn)入G0期，Rg1預(yù)處理組加入預(yù)定終濃度的Rg1，作用24 h后MOR組及不同濃度的預(yù)處理組加入終濃度為 100 μmol·L－1的嗎啡，NS組加入等體積的生理鹽水作用24 h。各組加入終濃度為0.5 g·L－1的MTT，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，加入每孔200 μl二甲基亞砜(DMSO)，將培養(yǎng)板平行振蕩10 min后，在酶標(biāo)儀上于490 nm處測定光吸收值。

1.5 SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i、CaMKⅡβ mRNA 及蛋白表達(dá)測定

1.5.1 實驗分組 對數(shù)生長期的細(xì)胞以1×106密度接種于培養(yǎng)瓶，實驗分為:NS組:加入與藥物等體積的 NS;MOR 組:加入終濃度為 100 μmol·L－1的嗎啡作用48 h;納洛酮催促戒斷組(NAL):加入終濃度為 100 μmol·L－1的嗎啡，作用 24 h，再加入終濃度為10 μmol·L－1的納絡(luò)酮，作用 30 min;Rg1 干預(yù)組(MOR+Rg1 1、2、4 μmol·L－1+NAL):加入終濃度為 100 μmol·L－1的嗎啡，作用 24 h 后，加入不同濃度的 Rg1，作用24 h，再加入終濃度為10 μmol·L－1的納絡(luò)酮，作用 30 min。

1.5.2 細(xì)胞懸液的制備 將實驗細(xì)胞用Hanks液洗2次，胰酶消化，離心后，重懸于含20 g·L－1牛血清白蛋白(BSA)Hanks液中，調(diào)細(xì)胞濃度為1×(109－1010)個·L－1。經(jīng)臺盼藍(lán)排斥試驗檢查，細(xì)胞成活率達(dá)95%以上可用于實驗。

1.5.3 雙波長熒光光度法檢測 SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i

1.5.3.1 Fura-2/AM 負(fù)載 將細(xì)胞懸液置37℃下預(yù)溫 5 min，加入 Fura-2/AM(終濃度 1 μmol·L－1)，37℃恒溫避光震蕩孵育 30 min，以含 20 g·L－1BSA的Hanks液洗2次，離心。加入3 ml含20 g·L－1BSA的Hanks液，調(diào)細(xì)胞密度為1×109～2×109個·L－1。

1.5.3.2 熒光測定［Ca2+］i熒光測定條件:激發(fā)光柵5 nm，發(fā)射光柵10 nm，發(fā)射光波長500 nm，激發(fā)波長為340 nm和380 nm交替掃描，測定靜息狀態(tài)下的熒光強度(F340，F(xiàn)380);加入終濃度為10 g·L－1的破膜劑Triton X-100溶液，測定最大熒光強度(Fmax340，F(xiàn)max380);加入終濃度為 5 mmol·L－1的EGTA溶液，測定最小熒光強度(Fmin340，F(xiàn)min380)。所測得數(shù)據(jù)均減去細(xì)胞自發(fā)熒光值(即空白對照管熒光值)后，根據(jù)公式［Ca2+］=Kd(R-Rmin)Fmin380/(Rmax-R)Fmax380，計算神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，其中Kd=224 nmol·L－1，R=F340/F380，Rmin=Fmin340/Fmin380，Rmax=Fmax340/Fmax380。

1.5.4 CaMKⅡβ mRNA的檢測 用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，取2.0 μg總 RNA，經(jīng) M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶42℃逆轉(zhuǎn)錄50 min，合成cDNA。CaMKⅡβ引物序列上游 5'-GACCCAGGGCTGACCTCGTTT-3'，下游5'-TGTGGATCGGCTTGCTGTTCTT-3'擴增片斷長度為115 bp;內(nèi)參 β-actin上游5'-GTCCAAATTCCAGCAGATGT-3'，下游 5'-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'擴增片斷長度為245 bp。擴增條件:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 15 s;58℃ 30 s;68℃30 s，循環(huán)36次。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g·L－1瓊脂糖凝膠電泳，用美國UVP凝膠圖像分析系統(tǒng)對電泳譜帶進(jìn)行半定量分析，用任意單位(AU)表示凝膠譜帶的面積×熒光強度值，CaMKⅡβ/β-actin的AU比值代表CaMKⅡβ mRNA相對表達(dá)水平。

1.5.5 CaMKⅡβ蛋白質(zhì)表達(dá)的檢測 收集細(xì)胞，提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。各組取蛋白40 μg，電泳分離后電轉(zhuǎn)移至NC膜。將膜置于5 g·L－1脫脂奶粉封閉1 h，加小鼠抗大鼠 CaMKⅡβ抗體(1∶80稀釋)，4℃孵育過夜，TBS洗膜后，加入HRP標(biāo)記的兔抗小鼠IgG二抗(1∶1 000稀釋)，37℃孵育1 h，TBS洗膜后采用化學(xué)發(fā)光法檢測結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參對照。用Scion-Image軟件對結(jié)果進(jìn)行半定量分析，用AU(Darea Ddensity)代表條帶的面積×熒光強度，以CaMKⅡα/β-actin的AU比值代表CaMKⅡα蛋白的相對含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 12.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件包處理，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)和進(jìn)行S-N-K兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 Rg1對嗎啡慢性作用于SK-N-SH細(xì)胞增殖的影響100 μmol·L－1嗎啡慢性作用 SK-N-SH細(xì)胞48 h，OD值與對照組相比降低，表明嗎啡可抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，在給予嗎啡之前，采用1、2、4、8、16、32 μmol·L－1劑量的 Rg1 預(yù)處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)濃度為2 μmol·L－1的Rg1可以緩解嗎啡對細(xì)胞的抑制作用(P＜0.01)。見Tab1。

Tab 1 Effects of Rg1 on cell multiplication in the SK-N-SH cells treated with chronic morphine( ± s，n=3)

Tab 1 Effects of Rg1 on cell multiplication in the SK-N-SH cells treated with chronic morphine( ± s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs NS group;##P＜0.01 vs MOR group

Group OD value NS 0.349 ±0.003 MOR 0.260 ±0.039＊＊Rg1 1 μmol·L －1+MOR 0.264 ±0.036 2 μmol·L －1+MOR 0.348 ±0.058##4 μmol·L －1+MOR 0.300 ±0.068 8 μmol·L －1+MOR 0.271 ±0.056 16 μmol·L －1+MOR 0.296 ±0.041 32 μmol·L －1+MOR 0.288 ±0.057

2.2 Rgl對慢性嗎啡作用納洛酮催促戒斷SK-NSH 細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i的影響100 μmol·L－1的嗎啡慢性作用SK-N-SH細(xì)胞48 h，細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i與NS組相比明顯升高 (P＜0.01);加入終濃度為10 μmol·L－1的納絡(luò)酮，作用 30 min，細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i低于嗎啡組(P＜0.01);納洛酮催促戒斷前24 h，加入不同終濃度的 Rg1 1、2、4 μmol·L－1，各組與NAL組相比，均可升高細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i水平(P＜0.01)。見Tab2。

Tab 2 Effects of Rg1 on ［Ca2+］iin the SK-N-SH cell treated with chronic morphine and naloxone-precipitated withdrawal(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs NS;△△P＜0.01 vs MOR;▲▲P＜0.01 vs NAL

Group ［Ca2+］i/nmol·L －1 NS 173.563 ±41.063 MOR 490.185 ±75.286＊＊NAL 161.989 ±16.967△△M+1+N 303.409 ±39.177▲▲M+2+N 298.99 ±37.833▲▲M+4+N 305.486 ±20.237▲▲

2.3 Rgl對慢性嗎啡作用納洛酮催促戒斷SK-NSH細(xì)胞CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達(dá)的影響嗎啡慢性作用可使SK-N-SH細(xì)胞CaMKⅡβ mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，加入納洛酮作用30 min后，可使細(xì)胞mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高(P＜0.05)。納洛酮催促戒斷前24 h，加入不同終濃度的 Rg1 1、2、4 μmol·L－1，各組 mRNA 與蛋白表達(dá)量與納洛酮組相比均有降低(P＜0.01)。結(jié)果見表 Tab 3 及 Fig 1，2。

Fig 2 Effects of Rg1 on expression of CaMKⅡβ protein in SK-N-SH cell treated with chronic morphine and naloxone-precipitated withdrawal

Tab 3 Effects of ginsenoside-Rg1 on the expression of CaMKⅡβ mRNA and protein in the SK-N-SH cells treated with chronic morphine and naloxone-precipitated withdrawal(±s，n=3)

Tab 3 Effects of ginsenoside-Rg1 on the expression of CaMKⅡβ mRNA and protein in the SK-N-SH cells treated with chronic morphine and naloxone-precipitated withdrawal(±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs NS;△△P＜0.05 vs MOR;▲▲P＜0.01 vs NAL

Group CaMKⅡ β mRNA(Ratio to β-actin)CaMKⅡ β protein(Ratio to β-actin)NS 0.319 ±0.077 0.470 ±0.036 MOR 0.800 ±0.099＊＊ 0.522 ±0.005＊＊NAL 0.879 ±0.045△△ 0.555 ±0.025△△M+1+N 0.449 ±0.053▲▲ 0.145 ±0.005▲▲M+2+N 0.634 ±0.048▲▲ 0.150 ±0.004▲▲M+4+N 0.725 ±0.026▲▲ 0.244 ±0.012▲▲

3 討論

近年來，體內(nèi)外實驗均表明阿片類物質(zhì)有抑制細(xì)胞增殖的作用［4］。本研究結(jié)果證實:100 μmol·L－1的嗎啡能明顯抑制SK-N-SH細(xì)胞的生長。其機制，Yang等［5］認(rèn)為，嗎啡作為μ阿片受體激動劑，通過鈣離子依賴機制抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化。以往的研究表明［6］，人參皂苷Rg1能提高脂多糖(LPS)處理的SK-N-SH細(xì)胞的存活率，對LPS造成的細(xì)胞毒性具有一定的保護(hù)作用。人參皂苷Rgl(4 μmol·L－1)對淀粉樣β蛋白25－35誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用［7］。本實驗結(jié)果證實人參皂苷 Rgl 2、4 μmol·L－1能有效地拮抗嗎啡對細(xì)胞的抑制作用，對SK-N-SH細(xì)胞有很好的保護(hù)作用。

Ca2+是廣泛存在于動植物細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度在嗎啡耐受與依賴機制中有著重要地位。慢性阿片長期處理，可使細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放鈣離子和胞外鈣離子內(nèi)流［8］，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，使機體處于病態(tài)的平衡狀態(tài)中，而停藥后或以納洛酮催促可使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i迅速釋放到突觸間隙，細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i減少，進(jìn)而引起神經(jīng)遞質(zhì)釋放驟增，使機體難以適應(yīng)而導(dǎo)致戒斷癥狀的發(fā)生［9］。本實驗中 100 μmol·L－1的嗎啡能增加SK-N-SH細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i，加入NAL催促戒斷使細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i急劇下降，與已有的研究結(jié)果一致。

前期我們的研究已證實［10］，三七總皂苷可以通過翻轉(zhuǎn)納洛酮急性降鈣作用，從而緩解嗎啡依賴大鼠催促戒斷癥狀。但這種作用是否與人參皂苷Rgl有關(guān)?為此，本研究在催促戒斷前加入不同濃度的人參皂苷 Rgl干預(yù)，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i與MOR組相比降低，但高于NAL組。人參皂苷Rgl是三七總皂苷的主要成分之一，李茜等［11］研究證實:人參皂苷Rg1可以通過抑制外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放明顯抑制了家兔離體小腸平滑肌的自發(fā)收縮幅度，證實Rg1是一種鈣拮抗劑。因此推測Rgl具有拮抗嗎啡成癮時外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放的作用，但其降鈣作用緩慢，通過緩解戒斷時胞內(nèi)［Ca2+］i的迅速釋放來緩解戒斷癥狀的產(chǎn)生。

鈣離子/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin dependent protein kinase CaMKⅡ)是一種多功能的絲氨酸/蘇氛酸蛋白激酶。CaMKⅡ可以直接地影響嗎啡依賴與戒斷。慢性嗎啡作用可增加大鼠海馬及額皮質(zhì)的CaMK基因表達(dá)［12］，而CaMKⅡ抑制劑KN93可翻轉(zhuǎn)嗎啡的這種作用，抑制納洛酮引起的催促戒斷癥狀［13］。說明CaMK在嗎啡成癮及戒斷中起著重要的作用。本研究證實:嗎啡慢性作用于SK-N-SH細(xì)胞48 h，可引起細(xì)胞內(nèi)CaMKⅡβ mRNA和蛋白表達(dá)的升高，嗎啡成癮細(xì)胞加入納洛酮急性戒斷后，則使CaMKⅡβ mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高，與文獻(xiàn)報道一致。有報道指出［14］，在阿片依賴細(xì)胞模型中，CaMKⅡ參與了μ受體的磷酸化與脫敏，可通過調(diào)節(jié)μ受體的磷酸化與脫敏而影響阿片依賴與成癮。本實驗在納洛酮急性戒斷前，加入不同濃度的Rg1，可阻斷CaMKⅡβ mRNA和蛋白表達(dá)的進(jìn)一步升高。其可能發(fā)生的機制是:嗎啡慢性作用引起細(xì)胞［Ca2+］i升高，升高的 Ca2+與CaM結(jié)合，形成Ca2+/CaM復(fù)合物，進(jìn)而激活CaMKⅡβ，使CaMKⅡβ mRNA和蛋白表達(dá)升高。Rg1可能通過抑制［Ca2+］i的升高，使 Ca2+/CaM復(fù)合物減少，抑制CaMKⅡβ mRNA和蛋白的表達(dá)，阻斷嗎啡成癮及戒斷的發(fā)生。

Ca2+-CaM-CaMK信號途徑是嗎啡成癮重要的信號通路之一，本研究從細(xì)胞增殖和細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i及CaMKⅡβ mRNA和蛋白幾個方面研究了三七單體人參皂苷Rgl對慢性嗎啡作用SK-N-SH細(xì)胞的影響。通過上述研究，提示:人參皂苷Rgl抑制嗎啡戒斷反應(yīng)可能通過拮抗嗎啡對細(xì)胞的抑制作用，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)［Ca2+］i以及影響CaMKⅡβ mRNA和蛋白表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。

［1］ 高學(xué)敏，顧慰萍.中醫(yī)戒毒輯要［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1997.

［1］ Gao X M，Gu W P.Brief compilation of drug abstinence by TCM［M］.Beijing:People’s Medical Publishing House，1997.

［2］ 郭 明，吳春福，王金輝，等.人參皂苷對嗎啡作用影響的研究進(jìn)展［J］.中國中藥雜志，2004，29(4):299 －301.

［2］ Guo M，Wu C F，Wang J H，et al.Effects of ginsenosides on the actions of morphine［J］.China J Chin Mater Med，2004，29(4):299－301.

［3］ 閆玉仙，呼文亮，叢 斌，等.三七總皂甙對嗎啡戒斷大鼠海馬磷酸化CREB蛋白表達(dá)及CREB/DNA結(jié)合活性的影響［J］.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，27(9):818 －20.

［3］ Yan Y X，Hu W L，Cong B，et al.Effects of Panax Notoginseng on phos-phorylated CREB protein expression and CREB/DNA binding activity in hippocampus of morphine withdrawal rats［J］.J Fourth Mil Med Univ，2006，27(9):818 －20.

［4］ Fuggetta M P，Di Francesco P，F(xiàn)alchetti R，et al.Effect of morphine on cell-mediated immune responses of human lymphocytes against allogeneic malignant cells［J］.J Exp Clin Cancer Res，2005，24(2):255－63.

［5］ Yang J C，Shan J，Ng K F，et al.Morphine and methadone have different effects on calcium channel currents in neuroblastoma cells［J］.Brain Res，2000，870(1 －2):199 －203.

［6］ Lu J H，Huang F，Liu Y L，et al.Effect of ginsenoside Rgl on neprilysin expression Induced by LPS in SK-N-SH cell line［J］.J Chin Med Mater，2005，28(2):117 －9.

［7］ 張大鵬，陳云波，王 奇，等.人參皂苷Rg1對淀粉樣β蛋白誘導(dǎo)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)［J］.中國臨床康復(fù)，2006，10(23):39－43.

［7］ Zhang D P，Chen Y B，Wang Q，et al.Protective effect of ginsenoside Rgl on hippocampal neuronal damage in rats exposed to betaamyloid protein［J］.Chin J Clin Rehab，2006，10(23):39 －43.

［8］ Connor M，Henderson G.De1ta-and muopioid receptor mobilization of intracellular calcium in SH-SY5Y human neuroblastoma cells［J］.Br J Pharmacol，1996，117(2):333 －40.

［9］ 房 蕾，朱永平.電壓依賴性鈣通道與阿片類藥物成癮之間的關(guān)系［J］.中國藥物依賴性雜志，2006，15(2):12 －5.

［9］ Fang L，Zhu Y P.Relation between voltage-dependent calcium channel and drug addiction of opioid ［J］.Chin J Drug Depend，2006，15(2):12 －5.

［10］陳海生，閆玉仙，張予陽，等.三七總皂甙對嗎啡戒斷大鼠皮質(zhì)、紋狀體神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣的影響［J］.武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，18(1):1 －4.

［10］Chen H S，Yan Y X，Zhang Y Y，et al.Effect of Panax Notoginseng Sapanins on［Ca2+］in cortex and striatum neurone of morphine withdrawal rats［J］.Acta Academ Med CPAF，2009，18(1):1 －4.

［11］李 茜，馬會杰，關(guān) 玥，等.人參皂苷Rg1對家兔離體小腸平滑肌自發(fā)收縮活動的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(10):1350－4.

［11］Li Q，Ma H J，Guan Y，et al.Influences of ginsenoside Rgl on spontaneous contraction of small intestine smooth muscle of rabbits in vitro［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(10):1350 －4.

［12］ Chen Y，Jing Y，Yue W，et al.Chronic，but not acute morphine treatment，up-regulates alpha-Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ gene expression in rat brain［J］.Neurochem Res，2008，33(10):2092－8.

［13］Liang D，Li X，Clark J D.Increased expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II alpha during chronic morphine exposure［J］.Neuroscience，2004，123(3):769 －75.

［14］Koch T，Kroslak T，Mayer P，et al.Site mutation in the rat muopioid receptor demonstrates the involvement of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in agonist-mediated desensitization［J］.J Neurochem，1997，69(4):1767 －70.