JNK信號通路參與Aβ毒性對大鼠海馬神經(jīng)元的損傷

叢偉紅，劉建勛，楊 斌，董小霞

(中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院1.實驗中心、2.病理室，北京 100091)

老年性癡呆(Alzheimers disease，AD)典型的組織病理學(xué)改變之一是腦內(nèi)出現(xiàn)大量的老年斑(Senile plaque，SP)，其核心成分是 β-淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide，Aβ)。Aβ的多種片段在體內(nèi)外均可引起神經(jīng)元凋亡，其毒性作用可能與c-Jun氨基端激酶(c-Jun NH2-terminal protein kinase，JNK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)［1-2］。目前涉及JNK與Aβ神經(jīng)毒性之間關(guān)系的實驗室研究多應(yīng)用原代神經(jīng)元、PC12等細(xì)胞或Tg2576、ASK1基因缺陷小鼠等轉(zhuǎn)基因動物。相較細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因模型，正常動物腦內(nèi)注射Aβ建立模型也是研究AD生理病理變化的重要手段之一，且兼具價廉、實驗周期短的優(yōu)點。本實驗通過Aβ1-40注射大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)建立毒性損傷模型，探討Aβ對海馬神經(jīng)元的影響以及神經(jīng)元凋亡上游JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在Aβ神經(jīng)毒性損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物Wistar大鼠，10只，♂，體質(zhì)量230～280 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號:SCXK(京)2006-0009。隨機(jī)分為假手術(shù)(對照)組和Aβ毒性損傷(模型)組，每組5只。

1.2 主要試劑細(xì)胞凋亡原位檢測(TUNEL)試劑盒，購自美國Intergen公司;多聚賴氨酸、p-JNK抗體，購自美國 Santa Cruz公司;Aβ1-40(HPLC級)、SP、DAB試劑盒，購自美國Sigma公司。Aβ1-40使用前于37℃孵育48 h。

1.3 方法

1.3.1 Aβ毒性損傷大鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)方法［3］建立Aβ毒性損傷大鼠模型，對照組注射生理鹽水。

1.3.2 組織切片制備 Aβ1-40注射后5周，以4%水合氯醛麻醉大鼠(1 ml/100 g體重腹腔注射)，左心室插管至主動脈，10%中性緩沖醛溶液灌注后取腦，切片厚5 μm，用于 HE 染色、Nissl染色、TUNEL染色和免疫組化實驗。

1.3.3 HE染色、Nissl染色觀察海馬病理學(xué)變化及神經(jīng)元存活情況 切片按常規(guī)進(jìn)行HE染色、Nissl染色，光鏡下觀察。

1.3.4 TUNEL法檢測神經(jīng)元凋亡 切片脫蠟，蛋白酶 K(20 mg·L-1，pH 7.4 ～ 8.0)37℃ 孵育;TUNEL反應(yīng)液和轉(zhuǎn)化劑-POD各37℃孵育1 h;DAB室溫孵育;蘇木精復(fù)染;IPP6.0軟件行圖像分析。不加TdT孵育為陰性對照。

1.3.5 免疫組化法觀察海馬p-JNK陽性神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目 切片抗原修復(fù)，滴加封閉液、一抗(1∶200)，4℃過夜。分別滴加HRP標(biāo)記IgG、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)37℃孵育;DAB顯色，蘇木精復(fù)染;IPP 6.0軟件行圖像分析。PBS代替一抗作陰性對照。

1.3.6 電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 迅速分離出海馬CA1區(qū)，在2.5%的戊二醛溶液中預(yù)固定4 h，1%鋨酸后固定2 h，系列乙醇脫水，環(huán)氧樹脂定向包埋，切片，片厚800?，鈾-鉛雙染色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用 SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均用±s表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 海馬病理學(xué)變化及神經(jīng)元存活情況正常組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞輪廓清晰，排列規(guī)則，著色均勻，核大明顯。模型組大鼠海馬多數(shù)細(xì)胞形態(tài)及染色與正常細(xì)胞類似，但細(xì)胞層數(shù)減少，排列較不規(guī)則，間隙增大，個別細(xì)胞體積變小，呈多邊形或梭形，核固縮，HE染色可見明顯增生的膠質(zhì)細(xì)胞，Nissl染色可見整個細(xì)胞深染成藍(lán)色，見Fig 1。

Fig 1 Light micrographs of HE-stained/Nissl-stained CA1 hippocampal neurons(×400)

2.2 海馬神經(jīng)元凋亡情況對照組大鼠海馬細(xì)胞核呈藍(lán)色，僅見極少數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞。模型組可見較多海馬細(xì)胞核呈棕黃色、固縮，見Fig 2。

2.3 大鼠海馬p-JNK陽性神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)目對照組大鼠海馬區(qū)僅見很少的p-JNK陽性神經(jīng)元。模型組部分海馬細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞帶不連貫，可見較多的p-JNK陽性神經(jīng)元，見Fig 3。

2.4 電鏡觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)對照組大鼠海馬神經(jīng)元核膜完整光滑，核大而圓，染色質(zhì)分布均勻，線粒體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)清晰。模型組大鼠海馬神經(jīng)元固縮，電子密度明顯升高，胞質(zhì)減少、空泡化，核膜扭曲，染色質(zhì)濃縮、邊集，核固縮。在凋亡神經(jīng)元周圍還可見膠質(zhì)細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)可見髓樣體。見Fig 4。

3 討論

Fig 2 Neuron apoptosis in hippocampus after Aβ injection(TUNEL staining)

Fig 3 Immunostaining of p-JNK expression in hippocampus

Fig 4 Electron micrographs of CA1 hippocampal neurons

AD患者腦內(nèi)Aβ的異常沉積是神經(jīng)元變性、丟失的重要原因。Aβ在凝集過程中可通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞和補體，釋放細(xì)胞因子和自由基等，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促使tau蛋白異常磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死;同時，SP內(nèi)的Aβ與炎癥反應(yīng)相互激發(fā)，放大凋亡信號，加重神經(jīng)元凋亡［4］。大鼠海馬注射Aβ后，HE和Nissl染色顯示海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層數(shù)較對照組減少，排列松散，個別細(xì)胞固縮、深染，表明海馬神經(jīng)元數(shù)目減少、細(xì)胞狀態(tài)發(fā)生異常改變。超微結(jié)構(gòu)觀察顯示明顯的凋亡特征:神經(jīng)元固縮，核膜明顯扭曲，核固縮，染色質(zhì)凝集于核膜下呈花瓣狀或團(tuán)塊狀。光鏡及電鏡下還可見凋亡神經(jīng)元周圍有明顯增生的膠質(zhì)細(xì)胞，表明Aβ可同時通過膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子啟動腦內(nèi)的炎癥修復(fù)機(jī)制，加重神經(jīng)元的凋亡和壞死。TUNEL染色進(jìn)一步觀察顯示，TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增加，表明海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡明顯增多。那么，作為神經(jīng)元外的病理成分，Aβ經(jīng)過哪條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引發(fā)了細(xì)胞內(nèi)的上述變化?

JNK信號通路被認(rèn)為是一條導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要通路，眾多神經(jīng)元凋亡的誘因如缺血/再灌注、氧化應(yīng)激、炎癥介質(zhì)等均以激活的JNK作為共需元素。已知c-Jun的持續(xù)性表達(dá)和磷酸化為神經(jīng)元凋亡所必需，Aβ誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡時，c-Jun的磷酸化水平呈時間依賴性升高［5］。JNK則是c-Jun磷酸化調(diào)節(jié)的一個重要因素，是MAPK家族中唯一能夠有效磷酸化c-Jun的Ser-63和Ser-73位點的蛋白激酶，從而啟動c-Jun介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。在AD患者腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積周圍神經(jīng)元內(nèi)的JNK信號通路被激活，同時伴有神經(jīng)元凋亡。大鼠海馬注射Aβ后，磷酸化JNK(p-JNK)陽性細(xì)胞比例較對照組明顯升高，且海馬神經(jīng)元凋亡明顯增多，同時伴有明顯增生的膠質(zhì)細(xì)胞。由于JNK活化后可直接轉(zhuǎn)錄caspase-8，啟動細(xì)胞凋亡，因而提示JNK信號通路被明顯激活，繼而參與了Aβ對海馬神經(jīng)元的毒性損傷，加速了神經(jīng)元的凋亡。

本實驗以正常動物建立模型，證實JNK信號通路參與了Aβ毒性對神經(jīng)元的損傷作用，為應(yīng)用細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因動物以外的模型進(jìn)行相關(guān)研究提供了一定的實驗依據(jù)。

［1］ Troy C M，Rabacchi S A，Xu Z，et al.β-amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation［J］.J Neurochem，2001，77(1):157-64.

［2］ Lin A，Dibling B.The true face of JNK activation in apoptosis［J］.Aging cell，2002，1(2):112-6.

［3］ 叢偉紅，劉建勛，徐 立.人參、銀杏葉提取物對淀粉樣蛋白1-40毒性損傷大鼠全腦神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(6):747-50.

［3］ Cong W H，Liu J X，Xu L.Effect of combination of extracts of ginseng and ginkgo biloba on neurotransmitters in whole brain of βamyloid peptide 1-40 treated rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(6):747-50.

［4］ Standridge J B.Vicious cycles within the neuropathophysiologic mechanisms of Alzheimer’s disease ［J］.Curr Alzheimer Res，2006，3(2):95-108.

［5］ Li L M，Liu Q H，Qiao J T，Zhang C.Abeta(31-35)-induced neuronal apoptosis is mediated by JNK-dependent extrinsic apoptosis pathway［J］.Neurosci Bull，2009，25(6):361-6.