人體食源性鹽酸克倫特羅尿樣興奮劑陽性可能性研究

張建麗 王占良 高照 劉欣 張亦農(nóng)國家體育總局反興奮劑中心（北京 100029）

鹽酸克倫特羅（clenbuterol）化學名為2-［（叔丁氨基）甲基］-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽，商品名為克喘素、平喘素等，是一種人工合成的β2-腎上腺素受體激動劑。其藥理作用為松弛支氣管平滑肌、增加肺活量、降低氣道阻力、增強支氣管纖毛運動和促進痰液排出，臨床上常用于防治哮喘、肺氣腫等呼吸系統(tǒng)疾?。?］。

除具有以上藥理作用外，克倫特羅還具有蛋白同化作用，因此作為興奮劑，該藥物是世界反興奮劑機構（World Anti-Doping Agency，WADA）禁止運動員使用的一種蛋白同化制劑［2］。近年來，鹽酸克倫特羅被非法用于飼養(yǎng)生豬，俗稱“瘦肉精”，其蛋白同化作用可促進動物肌肉生長，降低脂肪量，并在被飼養(yǎng)動物的肌肉組織和內(nèi)臟中殘留［1，3，4］。鹽酸克倫特羅化學結構相對穩(wěn)定，在體內(nèi)不易被破壞分解。含有該藥的肉類經(jīng)過126℃油煎5min，只能破壞一半殘留量［5］，常規(guī)烹調(diào)對克倫特羅殘留起不到破壞作用。如果運動員食用了殘留鹽酸克倫特羅的豬肉或豬內(nèi)臟，甚至有可能造成尿檢陽性，這將嚴重影響運動員的運動生涯。本實驗從對生豬進行不同方法定量添加鹽酸克倫特羅飼養(yǎng)開始，定量分析飼養(yǎng)的生豬各部位組織殘留的克倫特羅，接著對健康受試者進行定量食用烹飪熟的豬肉組織的人體受試研究，最后分析總結食源性鹽酸克倫特羅造成人體尿樣興奮劑陽性的可能性，為探討運動員是否會由于食用鹽酸克倫特羅喂養(yǎng)過的豬肉或豬內(nèi)臟造成尿檢興奮劑陽性的可能性提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

鹽酸克倫特羅對照品（中國藥品生物制品檢定所）；納多洛爾和甲基睪酮（Sigma公司）；高氯酸（上海金鹿化工有限公司）；氨水（北京化工廠）；甲酸（Dikma）；氫氧化鈉（北京化學試劑公司）；甲酸銨（國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（Dikma）；乙腈（Dikma）；HLB固相萃取小柱（Waters）；MCX固相萃取小柱（Waters）；叔丁基甲醚（Dikma）；β-葡萄糖醛酸甙酶（Sigma）；磷酸氫二鉀（北京化學試劑公司）；磷酸二氫鉀（北京化學試劑公司）；碳酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；碳酸氫鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；三甲基碘硅烷（Sigma）。

1.2 儀器及輔助設備

Agilent 1200HPLC/6130MS；AgilentZorbaxSB-C18 150mm×2.1mm×5μm；Agilent 6890GC/5973MS；IKA-T18組織勻漿機；VORTEX-2 GENIE渦旋混合器；MEGAFUGE 1.0R冷凍離心機；TECHNE氮氣濃縮儀；Waters固相萃取儀；KQ3200DE超聲波清洗儀。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

流動相為10mmol·L-1pH3.5甲酸銨（A）和乙腈（B），洗脫梯度為0min時A90%，2min時A90%，11min時A25%；流速為0.4ml·min-1；進樣量為20μl；掃描方式為選擇離子采集方式采集m/z 277（克倫特羅）和m/z 310（內(nèi)標）；干燥氣流速為9L·min-1；霧化氣壓力位40psi；柱溫為40℃。

1.4 動物受試及取樣

委托北京黎昌鈺鑫科技發(fā)展有限公司按不同劑量鹽酸克倫特羅和不同養(yǎng)殖周期專人單獨飼養(yǎng)6頭豬仔，飼養(yǎng)方式見表1。飼養(yǎng)到期后在屠宰場宰殺，取每頭豬前腿、后腿、里脊、腹肉、肝臟和腎臟六個部位部分組織冷藏。

表1 對豬仔進行鹽酸克倫特羅定量受試情況

1.5 豬肌肉組織樣品的提取與凈化［6］

提?。簻蚀_稱取 10.0g樣品，加入10ml水，勻漿約1min，用高氯酸調(diào)pH值至1.0，超聲振蕩20min。取上清液于干凈試管中，殘渣再用0.1mol·L-1高氯酸溶液10ml提取一次，離心，合并上清液。用12mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至4.0，此溶液待過HLB固相萃取小柱。凈化：HLB固相萃取小柱在使用前用6ml甲醇、6ml水活化。將提取液以2ml·min-1的速度過柱，棄去濾液，用5%甲醇氨2ml淋洗，小柱抽干。再用6ml甲醇洗脫。洗脫液用氮氣吹至近干。用0.1 mmoL·L-1高氯酸溶液3ml溶解殘渣，供MCX柱凈化用。MCX柱在使用前用3ml 5%甲醇氨、3ml甲醇、3ml水、3ml 0.1mmoL·L-1高氯酸溶液活化。將凈化后的溶液過柱，棄去濾液，依次用1ml甲醇、1ml 2%甲醇水溶液淋洗，最后用5%甲醇氨7ml洗脫，洗脫液用氮氣吹至近干，用1ml初始比例流動相溶解，用于LC/MS測定。

1.6 人體受試及取樣

兩名健康男性受試者，體重分別為85kg（一號受試者）和65kg（二號受試者）。人體受試前均已簽訂《知情同意書》。對已知鹽酸克倫特羅含量的一定重量豬肉或豬肝進行正常烹飪至熟，然后分別對兩名受試者進行單次定量受試。受試者留取3天內(nèi)所有尿樣，在受試期間正常飲水但不能再食用其他肉制品。

1.7 尿樣的前處理

取尿樣2ml加入50μl內(nèi)標（甲基睪酮，50ng·ml-1）甲醇溶液，加入 1ml磷酸緩沖液（pH約為 6.9），加入50μl β-葡萄糖醛酸甙酶（2500unit），55℃恒溫水浴保溫不少于60min，取出樣品冷卻至室溫，加入0.5ml堿性緩沖液（pH約為9.6），加入4ml叔丁基甲醚，振蕩萃取，離心后取上清液，55℃下氮氣吹干，加入50μl三甲基碘硅烷，振搖后轉移至尖底小瓶中封口，70℃恒溫 30min，GC/MS分析。

2 結果與分析

2.1 提取回收率

取空白基質(zhì)10.0g三份，分別加入10ng·μl-1鹽酸克倫特羅對照品100μl，再分別加入10ng·μl-1內(nèi)標50μl，按照“1.5豬肌肉組織樣品的提取與凈化［6］”進行提取凈化后，氮氣吹干，1ml初始比例流動相溶解后進行LC/MS分析，記錄克倫特羅的定量離子色譜峰面積（A1）和納多洛爾（內(nèi)標）的定量離子色譜峰面積（AIS1）。另取相同空白基質(zhì)10.0g，按照“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”進行提取凈化，提取液中分別加入與上述等量的對照品和內(nèi)標，氮氣吹干，1ml初始比例流動相溶解后進行LC/MS分析，記錄克倫特羅的定量離子色譜峰面積（A2）和納多洛爾（內(nèi)標）的定量離子色譜峰面積（AIS2）。按下式計算克倫特羅分別在豬肉和豬肝中的提取回收率（E）。E（%）=（A1/AIS1）／（A2/AIS2）×100%。結果見表2。

表2 回收率結果（n=3）

2.2 受試豬肌肉組織中鹽酸克倫特羅的定量分析

分別以空白豬肉和空白豬肝為基質(zhì)，建立標準曲線。稱取10.0g空白豬肉6份，分別制備成含有鹽酸克倫特羅的對照品 50ng·g-1、100ng·g-1、200ng·g-1、500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1和100ng·g-1納多洛爾（內(nèi)標）對照品的樣品，每一濃度點平行做三份，按“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”方法進行前處理，計算克倫特羅提取離子的峰面積與內(nèi)標提取離子的峰面積的比值，所得標準曲線為y=0.0026x+0.2205，R2=0.996，結果表明在豬肉基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅在50ng·g-1～2000ng·g-1范圍內(nèi)線性關系良好，見圖1。稱取10.0g空白豬肝六份，分別制備成含有鹽酸克倫特羅對照品 500ng·g-1、1000ng·g-1、2000ng·g-1、5000ng·g-1、8000ng·g-1、10000ng·g-1和100ng·g-1納多洛爾（內(nèi)標）對照品的樣品，每一濃度點平行做三份，按“豬肌肉組織樣品的提取與凈化”方法進行前處理，計算克倫特羅提取離子的峰面積與內(nèi)標提取離子的峰面積的比值，所得標準曲線為y=0.0008x+0.5413，R2=0.9951，結果表明在豬肝基質(zhì)中，鹽酸克倫特羅在500ng·g-1～10000ng·g-1范圍內(nèi)線性關系良好，見圖2。

圖1 豬肉中鹽酸克倫特羅的標準曲線

圖2 豬肝中鹽酸克倫特羅的標準曲線

對受試六頭豬的六個部位組織克倫特羅殘留量定量分析結果見表3。結果表明：（1）豬肉前腿、后腿、腹肉和里脊的克倫特羅含量無明顯差異；（2）肝臟和腎臟克倫特羅含量明顯高于前腿、后腿、腹肉和里脊；（3）從豬受試藥量與其組織中殘留藥量的關系可以得出，豬肉克倫特羅殘留量與其受試劑量及受試時間長短呈正相關。

表3 六頭豬的六個部位克倫特羅殘留量測試結果（ng·g-1）

2.3 人體受試的尿樣檢測結果（圖3～圖8）

圖3 一號受試者食用含鹽酸克倫特羅 175ng·g-1豬前腿125g后的尿排曲線

圖4 二號受試者食用含鹽酸克倫特羅 175ng·g-1豬前腿125g后的尿排曲線

圖5 一號受試者食用含鹽酸克倫特羅2467ng·g-1豬肝100g后的尿排曲線

圖6 二號受試者食用含鹽酸克倫特羅2467ng·g-1豬肝100g后的尿排曲線

圖7 一號受試者服用300μg的鹽酸克倫特羅對照品后的尿排曲線

圖8 二號受試者服用300μg的鹽酸克倫特羅對照品后的尿排曲線

為了考察食用動物肌肉組織和直接服用對照品的尿樣代謝差別，本實驗兩位受試者又同時服用了與豬肝中鹽酸克倫特羅等量的對照品，留取尿樣進行檢測，具體受試信息見表4。

3 總結

從上述人體受試后的尿樣檢測結果可以得出：兩位受試者在正常飲水的情況下，如果食用豬肉制品中克倫特羅總量不超過1μg，則不會產(chǎn)生興奮劑尿檢陽性。但服用殘留一定量克倫特羅的動物組織時，可能導致克倫特羅尿檢陽性。服用一定量對照品和食用等量含有克倫特羅的豬肉組織后，人體內(nèi)克倫特羅代謝無明顯差異。

表4 兩位健康受試者的受試情況

［1］徐國茂，胡翊煒，王錚，等.鹽酸克倫特羅檢測中存在的問題.廣東飼料，2007，16（3）:37-38.

［2］World Anti-Doping Agency.The 2009 prohibited list internationalstandard.http：//www.wada-ama.org/Documents/World Anti-Doping Program/WADP-Prohibited-list/WADA Prohibited List 2009 EN.pdf，2009.4-4.

［3］Dawson J.β-agonists put meat in the limelight again.Br Med J，1990，301:1238-1239.

［4］徐友宣.β2-受體激動劑克倫特羅的藥理及濫用.中國運動醫(yī)學雜志，2002，21（2）:222-224.

［5］張亞林，蔡世魁.控制鹽酸克倫特羅殘留危害刻不容緩.肉品安全，2007，24（11）:19-21.

［6］Analysis of β-agonists in foods of animal origin by high performance liquid chromatography tandem massspectrometry［GB］.GB/T 21313-2007:2-3.