耐力訓練對生長期大鼠血清OPG、sRANKL及骨代謝生化因子、骨量的影響

何淑敏 陳明

溫州大學體育學院（浙江溫州 325035）

OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)破骨細胞分化的重要信號傳導通路［1-3］。破骨細胞分化因子RANKL（receptor activator of nuclear factor κB ligand）是由成骨細胞和骨髓基質(zhì)細胞分泌的核因子－κB受體活化因子配體，它與破骨細胞的RANK（receptor activator of nuclear factorκB）結(jié)合，促進破骨細胞分化、成熟，提高其活性。RANKL的作用被認為是拮抗骨細胞分泌的另一因子—護骨素（osteoprotegerin，OPG）。OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的作用機制是：成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞表達RANKL，與破骨細胞前體細胞或破骨細胞表面上的RANK結(jié)合后，促進破骨細胞分化和激活。成骨細胞及骨髓基質(zhì)細胞則分泌OPG與RANKL競爭性結(jié)合，阻止RANKL與RANK結(jié)合，從而抑制破骨細胞活性。許多激素和因子通過影響OPG和RANKL的表達來影響骨代謝。在運動促進骨骼生長發(fā)育中，OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)可能在其中起到重要的作用。已有文獻［4］認為適宜運動可以維持良好的鈣代謝平衡，提高鈣調(diào)節(jié)激素的分泌，促進鈣的吸收和沉積，但目前尚無從OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)角度闡明運動促進骨密度、骨量增長機制的研究。本研究從OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)變化角度探討耐力運動對生長期大鼠骨代謝、骨密度和骨量影響的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選用20只3周健康雌性大鼠，由上海中國科學院實驗動物有限公司提供。以國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由飲食，室溫23±2℃，相對濕度55±5%，光照時間每天12小時，維持正常的24小時晝夜節(jié)律。經(jīng)過3周喂養(yǎng)和對環(huán)境的適應，大鼠達到6周齡，然后隨機分組實驗。

1.2 運動方案

20只6周齡大鼠稱重后隨機分成2組：對照組（Sed group）10只，不參加運動訓練，正常飲食及生活；②12周訓練組（Ex group）10只，進行12周跑臺訓練，每天1次，坡度為 0，第 1周 8m/min×10min，第 2周 15m/min×45min，第3周及以后25m/min×60min。本實驗模擬田徑運動中的有氧耐力跑形式。采用段氏PT98型鼠類跑臺進行訓練。

1.3 測試指標及檢測方法

1.3.1 血液標本的制備和檢測

12周實驗后，運動組停訓24小時，所有大鼠于安靜狀態(tài)下稱重后迅速斷頭取血，注入預冷的1%肝素塑料試管內(nèi)，混勻，低溫離心（3000r/min）10～15分鐘，取上清液置于－70°冰箱中待測血清維生素D3（VD3）、骨鈣素（OC）、骨堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）及 OPG和（可溶性）sRANKL。OPG和 sRANKL采用酶聯(lián)免疫法測定（由上海西唐生物科技有限公司提供試劑盒），OPG組內(nèi)、組間差異分別是3～5%和6～9%，sRANKL組內(nèi)、組間差異分別是4～10%和7～8%。血清OC、ALP、TRAP采用酶聯(lián)免疫法測定（試劑盒由上海滬尚生物科技有限公司提供），OC組內(nèi)、組間誤差分別是8%和5%；ALP組內(nèi)、組間誤差分別是5.2%和5.8%；TRAP組內(nèi)、組間誤差分別是5.7%和2.7%。維生素D由酶聯(lián)免疫法測定（英國IDS Ltd試劑盒），組內(nèi)、組間誤差分別是4.6%和5.3%。

1.3.2 骨骼標本的制備和檢測

動物斷頭后，取大鼠右側(cè)股骨、脛骨和第5腰椎，去除軟組織。測量3次股骨長度，取平均值。采用雙能X線骨密度儀（DEXA）（Madison，W I，USA）測定脛骨和腰椎骨密度（BMD）和骨量（BMC）。脛骨測定骨密度（BMD）和骨量（BMC）位置為中間部位。DEXA測定有效范圍是：脛骨寬15毫米、長50毫米；第5腰椎寬15毫米，長20毫米。骨密度和骨量測量誤差小于2%。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用 SAS 8.1（SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA）統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，數(shù)據(jù)以平均值和標準差表示，采用配對t檢驗對運動組與對照組相關(guān)指標之間差異的顯著性進行檢驗，P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 體重、股骨長度、脛骨和腰椎BMD、BMC

表1顯示，兩組大鼠實驗前基礎體重無顯著性差異。經(jīng)過12周運動訓練，兩組體重也無顯著差異。但運動組股骨顯著長于對照組（P<0.05）。而運動組大鼠脛骨BMC明顯高于對照組（P<0.01），BMD兩組無顯著性差異；同樣，運動組大鼠腰椎BMC顯著高于對照組（P<0.05），BMD兩組無顯著性差異。

表1 兩組大鼠體重、脛骨和腰椎BMD、BMC比較

2.2 血清OPG/sRANKL、維生素D及骨代謝生化標記物

表2顯示，運動組大鼠血清OPG水平明顯高于對照組（P<0.05），而 sRANKL明顯低于對照組（P<0.01）。運動組 OC（P<0.05）和 ALP（P<0.05）明顯高于對照組，而TRAP顯著低于對照組（P<0.05）。運動組血清維生素D也顯著高于對照組（P<0.05）。

表2 兩組大鼠血清骨代謝生化標記物、骨代謝調(diào)節(jié)因子比較

3 討論

本實驗結(jié)果顯示，12周實驗后，與對照組比較，運動組大鼠血清OPG升高而sRANKL下降，反映合成代謝指標OC、ALP升高而分解代謝指標TRAP降低；與此相應，運動組大鼠有更高的脛骨、腰椎骨量，提示OPG/RANKL系統(tǒng)的變化可能是運動促進生長期大鼠骨量增加的一個重要因素。有文獻報道OPG/RANKL系統(tǒng)是最重要的調(diào)節(jié)骨代謝的分子機制［1-3］。本研究結(jié)果表明：中等強度耐力運動使大鼠循環(huán)血OPG含量升高，sRANKL水平下降。這種變化可能是導致運動組大鼠骨量高于對照組的一個重要原因，其可能機制是：OPG升高和sRANKL下降都會導致sRANKL與破骨細胞膜上RANK受體結(jié)合的數(shù)量減少。由于RANKL-RANK配體受體結(jié)合是促進破骨細胞分化成熟的重要機制［1-3］，因此它們結(jié)合減少會導致破骨細胞分化、成熟受到抑制，破骨細胞數(shù)量下降，這樣成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡向成骨方向傾斜，結(jié)果是骨形成大于骨吸收，骨量增加。這在本實驗結(jié)果中也得到證實：運動組大鼠腰椎、頸骨骨量更高，而且反映骨吸收的代謝因子TRAP也比對照組低，反映骨合成的代謝指標OC和ALP卻高于對照組，這表明破骨細胞活性下降而成骨細胞活性增加，與OPG和sRANKL變化對骨組織的調(diào)節(jié)作用結(jié)果一致。Ziegler［5］報道耐力運動員循環(huán)血OPG水平升高，而sRANKL水平下降。這與本研究結(jié)果一致，但他們的實驗僅單獨測定OPG和sRANKL變化，未測定骨量、骨密度和骨代謝因子。miyazaki等［6］報道卵巢切除大鼠RNAKL水平顯著增加，骨吸收過程非?；钴S，指出RANKL是調(diào)節(jié)骨組織吸收過程的主要因素。因此，運動導致OPG升高和sRANKL下降可能是耐力運動促進大鼠骨量增加的重要原因。

那么，運動如何改變OPG和RANKL分泌呢？機械力刺激是調(diào)節(jié)OPG、RANKL變化的一個重要因素。劉麗等［7］的研究表明，骨骼在機械力作用下，RANKL mRNA表達減少34.4%，而OPG mRNA表達增加73%，表明生理性應力作用顯著影響大鼠骨細胞OPG和RANKL mRNA表達，提示對骨骼的機械力作用能減少骨組織吸收、促進骨組織形成。其它文獻也證明OPG/RANKL比例增加主要是運動本身對骨組織機械力作用的結(jié)果，以及間接通過改變激素分泌而影響OPG/RANKL比例［8］。

破骨細胞和成骨細胞在代謝過程中產(chǎn)生許多代謝因子，監(jiān)測其變化可以反映骨組織代謝平衡情況［9，10］。本實驗結(jié)果表明，運動組血清OC、ALP升高，而TRAP下降。這說明運動組大鼠成骨細胞活性增強而破骨細胞活性減弱，成骨作用大于骨吸收作用，導致骨量增加。這在實驗中也得到證明，運動組大鼠有更多的骨量。其它文獻也表明運動通過改變骨代謝過程而影響骨骼的生長發(fā)育［9，11］。本實驗結(jié)果表明耐力運動大鼠脛骨、腰椎骨量明顯比對照組增加，而BMD卻無顯著性差異。有文獻報道耐力運動對骨密度和骨量產(chǎn)生重要影響［10］，而本研究只發(fā)現(xiàn)骨量增加。分析原因，我們的研究對象是生長期大鼠，快速生長期大鼠骨骼體積迅速增加，而礦物質(zhì)積累明顯滯后，因此這個時期骨密度增長不明顯。而骨量由骨骼體積增長和礦物質(zhì)增加兩方面決定，因此，即使礦物質(zhì)增加不明顯而骨骼體積增加也會導致骨量增長，這也能從運動組股骨長度比對照組更長的結(jié)果得到證實。因此，耐力運動通過刺激骨骼體積增長而促進骨量增加。Iwamoto［4］也報道運動通過影響骨代謝變化而促進骨量增長，并認為這種良性變化是鈣的良性平衡結(jié)果，與調(diào)節(jié)鈣代謝的激素相關(guān)。本實驗結(jié)果也表明，運動組血清維生素D明顯高于對照組，故運動也通過影響激素分泌促進骨量增長。因此，運動通過本身對骨組織的機械力作用和影響激素分泌而起到促進骨骼生長發(fā)育的作用。

4 總結(jié)

運動導致OPG/sRANKL比例增加可能是耐力運動促進生長期大鼠骨量增加的重要因素，其可能機制是：運動對骨組織產(chǎn)生的機械力刺激導致OPG/sRANKL比率升高，而抑制破骨細胞活性，骨合成增加、吸收減少，腰椎、股骨骨量增加。

［1］ Ominsky MS，Li X，Asuncion FJ，et al.RANKL inhibition w ith osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats.JBone miner Res，2008，23（5）：672-82.

［2］姚靜，侯加法.OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)的研究進展.動物醫(yī)學進展，2006，27（2）：5-9.

［3］劉繼中，紀宗玲，陳蘇民.OPG/RANKL/RANK系統(tǒng)與骨破壞性疾病.生物工程學報，2003，19（6）：654-660.

［4］ Iwamoto J，Shimamura C，Takeda T，et al.Ef fects of treadmill exercise on bonemass，bonemetabolism，and calciotropic hormones in young grow ing rats.J Bone miner Metab，2004，22（1）：26-31.

［5］ Ziegler S，Niessner A，Richter B，et al.Endurance running acutely raises plasma osteoprotegerin and lowers plasma receptor activator of nuclear factor κB ligand.Metabolism，2005，54：935-938.

［6］ miyazaki T，Matsunaga T，miyazaki S，et al.Changes in receptor activator of nuclear factor-kappaB，and its ligand，os teoprotegerin，bone-type alkaline phosphatase，and tartrateresistant acid phosphatase in ovariectomized rats.J Cell Biochem，2004，93：503-512.

［7］劉麗，張曉聰，鄭茜聰，等.機械應力影響鼠骨髓基質(zhì)細胞骨保護素/NF-kB受體活化劑配體mRNA表達變化.細胞生物學雜志，2006，（5）：747-751.

［8］ Verborgt O，Tatton NA，Majeska RJ，et al.Spatial distribution of Bax and Bcl-2 in osteocyes after bone fatigue：complementary roles in bone remodeling regulation.J Bone miner Res，2002，17（5）：907-714.

［9］ IkiM，Morita A，Ikeda Y，et al.Biochemicalmarkers of bone turnover may predict progression to osteoporosis in osteopenic women：the JPOS Cohort Study.J Bone miner Metab，2007，25（2）：122-9.

［10］趙仁清.青春期女孩骨代謝生化標志物的變化特點及雌激素的調(diào)節(jié)作用.體育科研，2008，29（3）：94-96.

［11］ Jurimae J，Purge P，Jurimae T，et al.Bone metabolismin elite male rowers：adaptation to volume-extended training.Eur JAppl Physiol，2006，97（1）：127-32.