基于核磁共振的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于運動人體科學(xué)研究的優(yōu)勢與障礙

李江華 范葉飛 劉文鋒

1江西師范大學(xué)體育學(xué)院（江西南昌 330027）2宜春學(xué)院體育學(xué)院 3湖南師范大學(xué)體育學(xué)院

20世紀生物學(xué)經(jīng)歷了由宏觀到微觀的發(fā)展過程，由形態(tài)、表型的描述逐步分解、細化到生物體的各種分子及其功能的研究［1］。運動人體科學(xué)也不例外，進行了大量的細胞與分子水平的研究。然而在后基因組時代的研究中，科研人員逐漸意識到，雖然采取還原論方法（向微觀世界深入），在細胞甚至在分子層次對生物體都有了很具體的了解，但對生物體整體的行為卻很難給出系統(tǒng)、圓滿的解釋［2］。因此，基于整體思路的、以系統(tǒng)整體為研究對象的系統(tǒng)生物學(xué)應(yīng)運而生，并且科學(xué)家們紛紛預(yù)言系統(tǒng)生物學(xué)的研究將是21世紀生物學(xué)研究的主流趨勢［2］。

代謝組學(xué)（metabonomics）是新近發(fā)展起來的一種系統(tǒng)生物學(xué)研究方法［3］。被譽為“代謝組學(xué)之父”的英國帝國理工大學(xué)Nicholson教授曾經(jīng)將代謝組學(xué)定義為：“對生物系統(tǒng)因病理生理或基因改變等刺激所致動態(tài)多參數(shù)代謝應(yīng)答的定量測定”［4］。唐惠儒等人則提出更準確的定義應(yīng)該為：代謝組學(xué)是關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其變化規(guī)律的科學(xué)［5］。與傳統(tǒng)生物學(xué)將生命現(xiàn)象與少數(shù)幾個生物學(xué)指標(biāo)進行相關(guān)研究的方法（還原論方法）相反，代謝組學(xué)利用整體的分析方法對生命系統(tǒng)進行研究［6］，通過測量樣本中所有的代謝產(chǎn)物來反映生物體對不同刺激的反應(yīng)［7］。大部分哺乳動物的代謝組學(xué)研究利用一維核磁共振氫譜（1H NMR Spectroscopy）產(chǎn)生數(shù)據(jù)，所以又稱為基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)。目前代謝組學(xué)的研究正處于高速發(fā)展的階段，代謝組學(xué)的研究論文也一直以指數(shù)的方式增長，其應(yīng)用已經(jīng)波及到基礎(chǔ)生命科學(xué)、藥物研發(fā)、疾病生理、營養(yǎng)與植物藥學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多方面［8］。然而，在最需要整體研究的運動人體科學(xué)領(lǐng)域，除了Pohjanen等人［9］與我們所發(fā)表的幾篇論文外［10-12］，至今國內(nèi)外尚鮮有代謝組學(xué)的研究報道。鑒于此，本文對基于核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)研究方法進行介紹，并對其應(yīng)用于運動人體科學(xué)領(lǐng)域研究的優(yōu)勢和障礙進行分析，以供同行們選擇研究方法時參考。

1 基于NMR的代謝組學(xué)研究數(shù)據(jù)獲取方法

哺乳動物的代謝產(chǎn)物主要以尿液的形式排出體外，所以以哺乳動物為對象的代謝組學(xué)研究往往通過測試尿液中的代謝產(chǎn)物來獲取數(shù)據(jù)［13］。尤其是在人體研究中，尿液取樣的無創(chuàng)性與簡易性使之成為了代謝組學(xué)研究中最常用的測試對象。當(dāng)然，其它的體液，如血液、膽汁、腦脊液、汗液、精液、乳液、滑液、唾液等［13］，也能給出許多代謝的信息，因此在進行某些特定目標(biāo)的代謝組學(xué)研究中，也可成為測試對象。

目前，代謝組學(xué)研究所采用的測試技術(shù)主要包括三種：核磁共振（NMR）、色譜 -質(zhì)譜聯(lián)動（GC/LC-MS）、毛細管電泳-質(zhì)譜（CE-MS），不同的測試技術(shù)應(yīng)用于不同的研究領(lǐng)域［14］。其中NMR是唯一既能定性，同時又能在微摩爾范圍定量大量有機化合物的技術(shù)［15］，這一非選擇性特點使得研究人員在進行哺乳動物（代謝產(chǎn)物非常復(fù)雜）代謝組學(xué)研究時，常常利用一維核磁共振氫譜（1H NMR Spectroscopy）產(chǎn)生數(shù)據(jù)［16］。

2 基于NMR的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于運動人體科學(xué)研究的優(yōu)勢

2.1 整體性

運動人體科學(xué)是一門研究人體在運動過程中機能活動的變化特點、規(guī)律和與外界環(huán)境關(guān)系的科學(xué)［17］。人體是一個復(fù)雜動態(tài)的整體，過于微觀層面的研究，往往類似于“瞎子摸象”，難以反映人的整體狀態(tài)，其成果也很難應(yīng)用于指導(dǎo)實踐。例如，Macarthur等［18］在綜述“基因與運動表現(xiàn)”時就明確指出，雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多與運動能力相關(guān)的基因，但無論是在運動選材還是在指導(dǎo)運動員訓(xùn)練領(lǐng)域，這方面的研究都沒有實質(zhì)性的進展。顯然，運動員賽場表現(xiàn)并不是一個或幾個基因就能解釋的，后天因素也是絕不能忽略的，如訓(xùn)練、營養(yǎng)等［19］。

同時，完整的人體是由人體和與之共生的菌群兩部分組成的［20，21］，據(jù)報道，腸道菌群的細胞數(shù)量和基因組規(guī)模均至少為人體的 10倍［22，23］，因此，僅僅研究宿主本身的基因或細胞，最多只能認識正常人體的一小部分。研究結(jié)果已經(jīng)表明，人體內(nèi)微生物群落類似人體的一個器官，不但與人體健康息息相關(guān)，而且也與運動關(guān)系密切。Backhed等人［24］報道了腸道微生物能夠提高碳水化合物的利用率；喬德才等［25-27］發(fā)現(xiàn)運動負荷的變化可能改變運動員腸道菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)，并且穩(wěn)定的菌群區(qū)系結(jié)構(gòu)可能是運動員在劇烈運動條件下保持良好機能狀態(tài)的重要因素之一；我們在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)腸道菌群區(qū)系的差異可能是決定優(yōu)秀游泳運動員比賽表現(xiàn)的關(guān)鍵因素之一［8］。

人體最終排出的代謝產(chǎn)物不但能反映宿主機體本身的代謝，還能反映寄生菌群的代謝，以及宿主和菌群代謝活動的相互作用［20，28］，所以基于NMR的代謝組學(xué)方法在整體性研究生命體系功能變化方面具有其它方法難以比擬的優(yōu)勢［13，29］。在運動人體科學(xué)研究中，如果需要對人本身、菌群及其相互作用等在系統(tǒng)水平對所發(fā)生的生物事件進行整體性認識，那么基于NMR的代謝組學(xué)研究方法就將成為強有力的手段。

2.2 靈敏性

代謝產(chǎn)物作為生物系統(tǒng)的生理終端，對生理信號具有放大作用［30］。首先，人體內(nèi)各種代謝變化快速而又協(xié)調(diào)，幾乎都由酶催化或參與調(diào)節(jié)［31］。酶具有巨大的催化能力，它能加速反應(yīng)一百萬倍以上。因此，人體內(nèi)各種代謝反應(yīng)中，任何微小的生理調(diào)節(jié)，都會引起代謝產(chǎn)物的劇烈變化［32］。其次，以尿液為測試對象的代謝組學(xué)研究往往取晨尿進行研究，這又利用了時間放大效應(yīng)。從睡前排尿到早晨再次排尿，期間約7~8小時，即相當(dāng)于收集了實驗對象7~8小時內(nèi)所有的代謝產(chǎn)物，他們的生理差異可以通過這8個小時得到進一步放大。在我們的前期研究中，正是利用了這兩個信號放大器，成功的解決了同一比賽項目中優(yōu)秀運動員的相似性問題［8］。

2.3 時效性

在系統(tǒng)生物學(xué)研究中，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分別從基因和蛋白質(zhì)層面探尋生命的活動，而實際上細胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的，如細胞信號釋放、能量傳遞、細胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的［33］。同時基因組的變化不一定能夠得到表達，某些蛋白的濃度變化也可能因為這個蛋白不具備活性而沒有對系統(tǒng)產(chǎn)生影響。并且由于基因或蛋白的功能補償作用，某個基因或蛋白的變化會由于其它基因或蛋白的變化而得到補償，最后反應(yīng)的凈結(jié)果為零［34，35］。只有小分子的產(chǎn)生和代謝才是這一系列事件的最終結(jié)果，它能夠更準確地反映生物體系的即時狀態(tài)［36］，所以有人提出，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你什么可能會發(fā)生，而代謝組學(xué)則告訴你什么確實發(fā)生了［37］，甚至有人認為，代謝組學(xué)是最接近生物表型和最能有效反映細胞個體或群體功能的表征技術(shù)［35］。

2.4 取樣與樣品處理的簡易性及NMR檢測的全面性

在人體研究中，研究方法是否可行，不但受倫理學(xué)的限制，往往還取決于受試者的接受程度。基于NMR的代謝組學(xué)研究只需要通過測試尿液就能獲取大量的生理信息。尿液取樣無創(chuàng)、簡易，容易為受試者所接受，并且不存在倫理學(xué)問題，因此這種研究方法非常適合于對人體進行直接研究。

傳統(tǒng)的生化檢測手段常常需要選定一種或幾種待測化合物再行檢測。這樣不僅可能引入干擾物，而且往往會漏檢無法預(yù)見的或未知的成分。而在進行NMR檢測前，樣品不需要復(fù)雜的預(yù)處理，這樣既避免了在預(yù)處理過程中引入干擾物的可能，并且檢測相當(dāng)快速，常規(guī)的1H NMR譜只需幾分鐘就可給出結(jié)果。同時，NMR技術(shù)能在同一時間，以相同精度，檢測各種代謝物質(zhì)，不需要預(yù)先選定化合物，這種一網(wǎng)打盡式的分析方法能有效避免目標(biāo)化合物的漏檢［15］。

3 基于NMR的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于運動人體科學(xué)研究的障礙

3.1 非實驗因素對檢測結(jié)果的影響

由于人類個體的差異性和代謝組對內(nèi)外刺激固有的敏感性［30］，人類的代謝表型易受飲食、生活方式和其它各種環(huán)境因素的影響［38］。這些非實驗性因素會直接影響代謝組學(xué)研究結(jié)果的可信度和客觀性，這也是代謝組學(xué)的研究結(jié)果難以重復(fù)的主要原因。

飲食是影響人類代謝表型的最主要因素。以前的代謝組學(xué)研究已經(jīng)表明，飲食的改變會使人類的代謝表型產(chǎn)生明顯變化，例如：食用大豆異黃酮素后會引起脂蛋白、氨基酸以及碳水化合物等代謝物的改變［39］；“大量食肉者”尿液中肌酸、肉毒堿、乙酰肉毒堿以及三甲胺等物質(zhì)的含量明顯升高；“素食者”尿液中對-羥苯乙酸的含量明顯升高［40］；高牛奶飲食影響尿液中馬尿酸的分泌［5］；飲用菊花茶后尿液中馬尿酸、甘氨酸和肌酸酐的含量明顯升高［41］。

除了飲食，許多其它的因素也能引起人類代謝表型的變化。Lenz等人［42］報道，人類的尿液代謝指紋圖譜明顯受文化差異的影響；各種慢性或急性的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的代謝表型的變化也已經(jīng)被實驗證實［43］；運動對代謝表型的影響也已有報道［6］。另外，性別、年齡、晝夜節(jié)律等也是代謝組學(xué)研究必須考慮的問題，大量的動物實驗已經(jīng)證實了這些因素對實驗結(jié)果的影響［44］。

為了減少非實驗性因素對檢測結(jié)果的影響，代謝組學(xué)在動物研究中可以嚴格控制各方面的條件。但是人類生活在錯綜復(fù)雜的環(huán)境中，像對待動物一樣進行限制顯然不現(xiàn)實，因此，在結(jié)果分析時，利用數(shù)學(xué)方法降低噪聲是減少非實驗性因素影響的主流方向。有研究表明，利用正交信號校正（orthogonal signal correction，OSC）等方法，可以較好地控制飲食、生活方式等環(huán)境因素所造成的干擾［45］。另外，在我們的前期研究中，通過多次取樣，計算變異系數(shù)，選擇相對穩(wěn)定的主成分來反映高水平游泳運動員的運動能力，也取得了很好的效果，成功地克服了運動員飲食、活動、生活方式無法控制的難題［8］。但是，這些方法只能在一定程度上減少非實驗性因素對研究結(jié)果的影響，完全消除是不可能的，所以代謝組對內(nèi)外刺激固有的敏感性既是代謝組學(xué)研究的優(yōu)勢所在，又是代謝組學(xué)研究的最大障礙。

3.2 模式識別

人類的代謝產(chǎn)物組成復(fù)雜，尿液中眾多的小分子代謝產(chǎn)物通常會在一維1H NMR譜產(chǎn)生成千上萬的共振峰［13］，即使是經(jīng)驗豐富的波譜學(xué)家也很難從復(fù)雜的NMR譜中獲得完整的信息［46］。要想解讀如此復(fù)雜的信息，就必須借助以計算機信息技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的模式識別技術(shù)。模式識別技術(shù)大體上可以分為兩類：無監(jiān)督的方法（unsupervised methods）和有監(jiān)督的方法（supervised methods）。

無監(jiān)督方法針對那些不利用或沒有樣本所屬類別信息的情況?；驹硎菍?fù)雜的數(shù)據(jù)（如NMR譜）降低到一個低維空間，從而使系統(tǒng)分析更加容易。該方法包括兩個步驟：數(shù)據(jù)縮減算法的實現(xiàn)，以及識別出的模式和聚類的圖形顯示。這些方法主要包括主成分分析（principal components analysis，PCA）、系統(tǒng)聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、非線性影射（non-linear mapping，NLM）和最小生成樹等。

有監(jiān)督方法是己知訓(xùn)練集樣本所屬類別的條件下的分類方法，它需要有一訓(xùn)練集。例如，對于兩類的情況，在訓(xùn)練集中，有一些樣本屬于A類，另外一些樣本屬于B類，然后教給計算機識別方法，計算機經(jīng)過訓(xùn)練之后則可識別未知樣本。這種方法往往用來進行預(yù)測和診斷，包括線性判別分析、逐步判別分析、偏最小二乘法、K-最近鄰法、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等。

然而，無論哪種模式識別方法都要用到較為復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型，對數(shù)學(xué)模型的理解程度不但決定了我們能否正確選擇模式識別方法，也關(guān)系到我們對實驗結(jié)果的解讀。因此，代謝組學(xué)研究往往在課題設(shè)計初期就需要有統(tǒng)計學(xué)專家或者化學(xué)計量學(xué)專家參與。

3.3 技術(shù)壁壘

NMR儀價格昂貴，操作復(fù)雜，通常需要在專業(yè)實驗人員的協(xié)助下才能完成樣品測試，獲得1H NMR譜。然而原始的1H NMR譜圖由于數(shù)據(jù)量過大、數(shù)據(jù)點的高度相關(guān)性以及溶劑峰、溶劑峰壓制后的殘基峰和相位、基線等帶來的影響而不能直接拿來做模式識別分析，研究人員必須對NMR譜進行預(yù)處理［46］。這一過程一般包括了相位校正、基線校正、溶劑峰的處理、NMR譜分段積分和積分數(shù)據(jù)的標(biāo)準化處理。由于我國運動人體科學(xué)的研究人員主要來自于體育和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，完成這一過程相對較難。然而更難的還在后面，代謝組學(xué)研究最重要的功能是發(fā)現(xiàn)特異性的生物標(biāo)志物，因此，在模式識別之后，必須對相關(guān)的NMR譜峰進行歸屬（即指認相應(yīng)的峰所代表的代謝物），這部分工作對于從事分析化學(xué)研究的人員都是難題，如果沒有經(jīng)驗豐富的專家指導(dǎo)，確實很難完成。

4 小結(jié)與展望

在后基因時代，代謝組學(xué)這一新興的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法為人體的研究提供了新的思路和手段。鑒于國際上代謝組學(xué)的發(fā)展，已經(jīng)有院士建議將“醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)”研究納入國家和社會可持續(xù)發(fā)展的戰(zhàn)略地位加以考慮。運動人體科學(xué)領(lǐng)域也同樣迫切需要代謝組學(xué)方法來研究人體在運動過程中機能活動的變化特點、規(guī)律和與外界環(huán)境的關(guān)系。然而由于NMR儀器昂貴，技術(shù)平臺較高，結(jié)果分析困難，并且往往還需要克服非實驗因素對檢測結(jié)果的影響，目前，這一領(lǐng)域的研究人員獨立進行基于NMR的代謝組學(xué)研究還相對困難，與其他的科研機構(gòu)和其他學(xué)科的研究人員進行跨學(xué)科合作應(yīng)該是較好的發(fā)展方向。

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