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    氯胺酮在大鼠體內(nèi)死后的分布研究1)

    2010-02-26 01:53:26王大利萬東方尉志文王雪彥贠克明王玉瑾
    關(guān)鍵詞:檢材法醫(yī)學(xué)氯胺酮

    王大利,萬東方,王 勇,尉志文,王雪彥,贠克明,王玉瑾

    氯胺酮(Ketamine)又稱凱他敏,在我國俗稱“K粉”,化學(xué)名為2-鄰氯苯基-2-甲胺基-環(huán)己酮。氯胺酮作用機(jī)制復(fù)雜,涉及NMDA受體、阿片類受體、單胺類受體、毒蕈堿受體和電壓依賴性鈣通道受體等,同時(shí)具有中樞興奮、中樞抑制、鎮(zhèn)痛、抗焦慮、麻醉、致幻等作用。醫(yī)療上主要用于術(shù)前的肌肉松弛劑,全身麻醉的誘導(dǎo)劑、麻醉輔助劑等[1]。氯胺酮濫用已超過30年[2],也有報(bào)道利用其投毒的報(bào)道[3]。目前對氯胺酮的研究主要集中在作用機(jī)制、檢測方法[4-9]、生物檢材中氯胺酮的檢測[10]。與其死因判定有關(guān)法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究報(bào)告較少。本實(shí)驗(yàn)在前期研究中進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分布和死后再分布研究[11-13],在此基礎(chǔ)上進(jìn)行研究氯胺酮中毒致死大鼠死亡當(dāng)時(shí)體內(nèi)分布的情況及影響因素。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑 儀器 TRACE GC&DSQ氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國 Thermo Finnigan公司;TRACE 2000 GC氣相色譜儀,美國 Thermo Finnigan公司。

    氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Finnigan)條件:DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 m ×0.25μm),EI源 70ev;質(zhì)量范圍:50~650,柱溫120μC(1 min)→20μC/min→280μC(8 min);離子源溫度:200 μC,傳輸線溫度:250μC,載氣:He 1.5m l/min。

    氣相色譜(Finnigan)條件:DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25μm),柱溫為程序升溫:120℃(1min)→20℃/min→280℃(8 min);進(jìn)樣口,240℃,分流進(jìn)樣;檢測器,NPD,300℃;空氣60 KPa;氫氣2.3 KPa;載氣,高純氮?dú)?1.5 m l/min。

    試劑:氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)品(2 mg/m L由中國公安部二所提供);氯胺酮針劑(3%,江蘇嘉隆化工有限公司,產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號:HG 3622-1999)。

    1.2 動(dòng)物模型 雄性Wistar大鼠12只,體重200 g±20 g,隨機(jī)分2LD50組和4LD50組,每組6只,實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食。經(jīng)灌胃勻速注入氯胺酮針劑17.28×10-3m l/g(2LD50)和氯胺酮針劑34.55×10-3m l/g(4LD50)氯胺酮。迅速解剖動(dòng)物,取心樣冷凍保存,堿性無水乙醚提取,氣相色譜質(zhì)譜法定性、氣相色譜定量檢測。

    1.3 樣品提取和檢測 取固體檢材1 g或血1 m L,加蒸餾水1 mL,加入內(nèi)標(biāo)液(SKF525A)10μL,振蕩,固性檢材超聲細(xì)胞粉碎(JYD-650L智能型)勻漿3 min,10%NaOH調(diào)酸p H 11~13,振蕩搖勻,加入5 mL無水乙醚,振蕩15 min,1800 r/min離心10 min,將上清液移入另一干凈干燥試管中,重復(fù)萃取一次。40℃恒溫水浴中揮干,20μL無水乙醇定容,取1μL進(jìn)樣檢測,保留時(shí)間定性,內(nèi)標(biāo)法和工作曲線法定量。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用定性。

    1.4 工作曲線 分別取空白大鼠肝臟1 g或血1 m L,分別加入氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液及SKF525A內(nèi)標(biāo)溶液,配制成含有氯胺酮1 μg/g、2μg/g、4μg/g、8μg/g、16μg/g、24μg/g、48μg/g、64μg/g(或μg/m L),SKF525A20μg的系列樣品,按樣品提取檢測方法進(jìn)行。以氯胺酮濃度(μg/g)為橫坐標(biāo)(X),氯胺酮與內(nèi)標(biāo)SKF525A的峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸,所得線性回歸方程(肝臟)Y=1.203X-0.54,r2=0.9811、(血液)Y=1.357X+1.158,r2=0.9962,結(jié)果表明,肝及血中氯胺酮在1μg/g~48μg/g(或μg/mL)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    1.5 回收率 空白肝及血液分別加入氯胺酮標(biāo)準(zhǔn)溶液4μg、16 μg、48μg,工作曲線法計(jì)算檢材中氯胺酮含量,肝及血液的提取回收率分別為(95.8±5.4)%~(118.3±6.2)%、(97.8±2.4)%~(128.3±3.2)%。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS 11.5軟件,行方差分析及t檢驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

    2 結(jié) 果

    2.1 2LD50組和4LD50組大鼠體內(nèi)氯胺酮的死后分布(見表1)

    表1 氯胺酮在大鼠體內(nèi)死后分布(±s)

    表1 氯胺酮在大鼠體內(nèi)死后分布(±s)

    劑量 心血(μg/m L) 心(μg/g) 肝(μg/g) 脾(μg/g) 肺(μg/g) 腎(μg/g) 腦(μg/g) 肌肉(μg/g)2LD50 9.11±0.35 3.08±1.75 178.81±65.35 18.48±3.64 18.29±9.83 29.99±14.39 302.40±51.07 16.87±8.004LD50 144.51±26.24 121.17±23.78 848.93±63.91 134.02±39.22 415.39±59.47 935.49±14.271197.74±323.02 32.00±6.85

    2.2 GC和 GC/M S檢測 氯胺酮和SKF525A保留時(shí)間分別為7.57 min和9.46 min,峰形對稱,可完全分離,溶劑和空白臟器提取內(nèi)源性雜質(zhì)對氯胺酮和SKF525A無干擾。詳見圖1~4。

    3 討 論

    本研究建立的氯胺酮染毒大鼠的死后分布模型顯示,不同劑量(2LD50、4LD50)氯胺酮灌胃后在10 min~30 min內(nèi)死亡。此模型簡便易復(fù)制,可應(yīng)用于氯胺酮的法醫(yī)毒物動(dòng)力學(xué)研究[11-12]。

    本研究采用GC/MS定性,GC內(nèi)標(biāo)法和工作曲線法定量,具有操作簡便、快速,定性定量準(zhǔn)確的特點(diǎn)[13]。可應(yīng)用于氯胺酮中毒案件的檢驗(yàn)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各臟器組織氯胺酮含量:①2LD50組,腦>肝 >腎 >肺、脾、肌、心血、心;②4LD50 組 ,腦、腎、肝 > 肺 > 心血、脾、心>肌。氯胺酮死后分布不均勻與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。影響藥物在機(jī)體中分布的因素很多,主要有藥物的脂溶性、毛細(xì)血管通透性、器官和組織的血流量、與血漿蛋白和組織蛋白的結(jié)合率等。氯胺酮蛋白結(jié)合率低,脂溶性高,可迅速通過血腦屏障,因此其在腦組織中的含量最高,同時(shí)也是其作用的靶器官,從而導(dǎo)致主要神經(jīng)精神癥狀;氯胺酮主要由腎臟排泄和腎小管對氯胺酮的重吸收可能是造成腎臟內(nèi)濃度較高的原因;氯胺酮在肝臟中濃度較高可能主要因?yàn)槠?0%~90%在肝臟代謝,存在首關(guān)消除也可能是其影響因素。其次,不同劑量對死后分布存在明顯的影響。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,在實(shí)際氯胺酮中毒(死)案件中,檢材提取以腦、肝、腎最好,可利用其死后分布規(guī)律推測血中氯胺酮濃度;其次,由于氯胺酮為堿性藥物,易發(fā)生死后再分布,故應(yīng)及時(shí)提取檢材。

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