中藥制劑微生物限度檢查方法研究進(jìn)展

陶 紅

（廣西柳州市柳鐵中心醫(yī)院藥劑科，柳州市 545007）

作為中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)目?jī)?nèi)容之一的微生物限度檢查是保障藥品使用安全的重要工作，日益受到重視。微生物限度檢查系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法，檢查項(xiàng)目包括細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查[1]。我國(guó)開(kāi)展藥品微生物檢驗(yàn)工作起步較晚，始于1972年，直到1995年版《中國(guó)藥典》才正式收載了微生物限度檢查項(xiàng)，2000年版《中國(guó)藥典》雖然又作了較大修訂且增收了以劑型載入的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)，但未規(guī)定對(duì)含抑菌成分的藥品進(jìn)行處理，2005年版《中國(guó)藥典》“微生物限度檢查”項(xiàng)下新增了微生物檢查方法學(xué)驗(yàn)證[2]，這是對(duì)歷版《中國(guó)藥典》在微生物檢查法中的最主要補(bǔ)充。對(duì)于具有抑菌作用的中藥制劑，由于抑菌活性的干擾，用常規(guī)法檢查微生物限度的結(jié)果不能真實(shí)反映出藥品中污染微生物的情況，為此，進(jìn)行藥品檢驗(yàn)前必須采用適當(dāng)?shù)姆椒?，如培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心沉淀法或中和法消除供試液抑菌活性后，再根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查。同時(shí)，所采用檢測(cè)方法需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品的抑菌活性和保證測(cè)定方法的可靠性，從而提高藥品本身污染微生物的檢出率。為了對(duì)規(guī)范中藥制劑的微生物限度檢查法提供科學(xué)依據(jù)，更好地控制中藥制劑的質(zhì)量，本文特對(duì)近幾年已經(jīng)建立微生物限度檢查法的一些中藥制劑及其驗(yàn)證研究情況作如下歸納、綜述。

1 無(wú)抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

中藥制劑中不含抑菌成分時(shí)，一般用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度的檢查。吳宗彬[3]通過(guò)采用常規(guī)法對(duì)重感靈片微生物限度檢查進(jìn)行研究。結(jié)果，供試品5種試驗(yàn)菌回收率試驗(yàn)均達(dá)到70%以上，按照2005年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法中的規(guī)定[2]：微生物限度檢查回收率試驗(yàn)中，若試驗(yàn)組的菌回收率均不低于70%，則照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)。由此說(shuō)明重感靈片無(wú)明顯抑菌現(xiàn)象，可采用常規(guī)法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌的檢查。按照2005年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法進(jìn)行控制菌的檢查[2]，結(jié)果，3批菌大腸埃希菌和3批大腸菌群檢查試驗(yàn)組均可檢出試驗(yàn)菌，陰性組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陰性對(duì)照菌均無(wú)生長(zhǎng)，說(shuō)明重感靈片無(wú)明顯抑菌現(xiàn)象，可采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌大腸埃希菌和控制菌大腸菌群的檢查。韋紅等[4]運(yùn)用常規(guī)法探討了該法對(duì)六味地黃丸微生物限度檢查的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果，該供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%，故本品無(wú)抑菌作用，因此采用常規(guī)法可以進(jìn)行本品的微生物限度檢查。按照2005年版《中國(guó)藥典》微生物限度檢查法進(jìn)行控制菌檢查，結(jié)果，控制菌檢查陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，說(shuō)明本品對(duì)大腸埃希菌、大腸菌群沒(méi)有抑菌作用；陰性菌均未檢出，表明該控制菌檢查方法的專屬性好，可用于控制菌檢查。趙娟[5]通過(guò)對(duì)通脈膠囊的微生物限度檢查研究，發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)方法檢查，該樣品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的加菌回收率均高于70%，說(shuō)明樣品對(duì)上述種菌均沒(méi)有抑制作用，所以可以用常規(guī)法可以進(jìn)行本品的微生物限度檢查。韋紅等[6]采用常規(guī)法對(duì)黃連上清丸微生物限度檢查進(jìn)行研究。結(jié)果表明，該供試品采用常規(guī)方法對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%，稀釋劑對(duì)5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%，故本品無(wú)抑菌作用，而且對(duì)控制菌檢查陽(yáng)性菌生長(zhǎng)良好，陰性菌均未檢出。因此，采用常規(guī)法可以進(jìn)行本品的微生物限度檢查和控制菌檢查。

2 兼有抑菌與無(wú)抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

一般情況下，中藥制劑所含的成分較為復(fù)雜，有的中藥制劑對(duì)有些菌沒(méi)有抑菌作用，而對(duì)另外一些菌有抑菌作用。對(duì)于前者可采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度的檢查；后者要應(yīng)用培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心沉淀法或中和法消除供試液抑菌活性后，再根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行微生物限度的檢查。

解翠珠等[7]通過(guò)采用常規(guī)法、薄膜過(guò)濾法和稀釋法對(duì)紫丹活血片微生物限度檢查進(jìn)行研究。該供試品接種5株陽(yáng)性試驗(yàn)菌株，采用常規(guī)法對(duì)枯草桿菌、白色念珠菌回收率均低于70%，表明該供試品對(duì)這2種菌株有抑制作用，而對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌回收率均高于70%，說(shuō)明紫丹活血片對(duì)這幾種菌無(wú)抑菌作用；而薄膜過(guò)濾法對(duì)枯草桿菌、白色念珠菌回收率均高于70%，表明薄膜過(guò)濾法對(duì)這2種菌無(wú)抑菌作用。因此，紫丹活血片微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)方法為細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌均需采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行測(cè)定；采用常規(guī)法對(duì)控制菌大腸埃希菌進(jìn)行檢查及驗(yàn)證時(shí)，試驗(yàn)組檢測(cè)不到試驗(yàn)菌，采用稀釋法試驗(yàn)組均可檢出試驗(yàn)菌，陰性組均無(wú)菌生長(zhǎng)，陰性菌對(duì)照組均無(wú)生長(zhǎng)，可用稀釋法對(duì)控制菌檢查。汪成偉等[8]通過(guò)對(duì)桂枝茯苓膠囊微生物限度檢查的研究發(fā)現(xiàn)，大腸埃希桿菌、白色念珠菌及黑曲霉回收率高于70%，而金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌回收率低于70%，因此大腸埃希桿菌、白色念珠菌及黑曲霉可采用常規(guī)法；采用培養(yǎng)基稀釋法，可使金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的回收率高于70%，表明采用培養(yǎng)基稀釋法可以對(duì)桂枝茯苓膠囊中的金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的檢查。鄭麗莉等[9]通過(guò)采用常規(guī)法、薄膜過(guò)濾法和稀釋法對(duì)七葉神安片微生物限度檢查進(jìn)行研究。結(jié)果，采用常規(guī)法5株菌種的回收率只有大腸埃希桿菌和白色念珠菌的大于70%，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉的回收率均低于70%，培養(yǎng)基稀釋法黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的回收率大于70%，培養(yǎng)基稀釋法和離心集菌培養(yǎng)基稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌的回收率仍低于70%，采用離心薄膜過(guò)濾法，金黃色葡萄球菌的回收率可超過(guò)70%，表明該供試品對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑制作用。因此，可用常規(guī)法對(duì)七葉神安片中大腸埃希桿菌和白色念珠菌的檢查，用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)黑曲霉菌和枯草芽孢桿菌的檢查，用離心薄膜過(guò)濾法對(duì)金黃色葡萄球菌檢查。陳建啟等[10]通過(guò)對(duì)清感九味丸微生物限度檢查的研究，可以看出采用常規(guī)法對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉回收率不低于70%，其它菌低于70%；培養(yǎng)基稀釋法對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收率仍低于70%，表明仍然不能消除其抑菌活性；采用離心-薄膜過(guò)濾法對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌可消除其抑菌活性，2種種菌回收率高于70%。因此，清感九味丸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的代表菌株金黃色葡萄球菌和藥品中常見(jiàn)的污染菌株枯草芽孢桿菌抑菌作用較強(qiáng)，常規(guī)法和培養(yǎng)基稀釋法回收率都達(dá)不到70%，只有用離心-薄膜過(guò)濾各代表菌回收率才達(dá)到70%；對(duì)于控制菌采用常規(guī)法，結(jié)果試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，陰性菌對(duì)照組未檢出陰性對(duì)照菌，說(shuō)明用常規(guī)法即可檢出大腸埃希菌、大腸菌群。

3 有抑菌成分的中藥制劑的檢查方法

中藥制劑所含的成分中有抑菌作用時(shí)，首先要選用適當(dāng)?shù)姆椒?，如培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法、離心沉淀法消除供試液抑菌活性后，再根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定的方法進(jìn)行檢查。

解翠珠等[11]通過(guò)采用常規(guī)法、稀釋法和薄膜過(guò)濾法對(duì)鹽酸小檗堿片微生物限度檢查進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)常規(guī)法對(duì)5株陽(yáng)性試驗(yàn)菌株回收率均低于70%，說(shuō)明鹽酸小檗堿片不能應(yīng)用常規(guī)法進(jìn)行微生物的檢查；而稀釋法對(duì)黑曲霉、大腸桿菌回收率均高于70%；薄膜過(guò)濾法對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、白色念珠菌回收率均高于70%，說(shuō)明該樣品具有很強(qiáng)的抑菌活性，需采用薄膜過(guò)濾法消除該供試品的抑菌活性。對(duì)于控制菌，采用稀釋法可以消除供試液對(duì)大腸埃希菌的抑菌性，因此可采用稀釋法進(jìn)行控制菌的檢查。張玉蘭等[12]通過(guò)對(duì)復(fù)方丹參片微生物限度檢查研究，參照2000年版《中國(guó)藥典》、《藥品微生物檢驗(yàn)手冊(cè)》和2000年版《中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》收載的微生物限度檢驗(yàn)方法，運(yùn)用常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法、薄膜過(guò)濾法3種方法比較。結(jié)果表明，常規(guī)法，培養(yǎng)基稀釋法均不能消除藥品中抑菌物質(zhì)干擾，而薄膜過(guò)濾法相對(duì)檢出率高而且能充分濾除藥品中抑菌物質(zhì)，有效檢出該藥品中污染存活的細(xì)菌；該方法的陽(yáng)性對(duì)照菌的平均回收率為82.11%。因此，可以用薄膜過(guò)濾法作為復(fù)方丹參片微生物限度檢查的方法。余俊等[13]通過(guò)采用2005年版《中國(guó)藥典》（一部）規(guī)定的常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法進(jìn)行菌回收率比較試驗(yàn)，對(duì)銀黃顆粒、清喉利咽顆粒、柴黃顆粒3種中成藥的微生物限度檢查進(jìn)行研究。結(jié)果表明，3種藥品在常規(guī)法檢測(cè)金黃色葡萄球菌回收率均低于70%。采用培養(yǎng)基稀釋法，金黃色葡萄球菌回收率均高于70%，說(shuō)明3種中成藥在常規(guī)法檢測(cè)時(shí)均有一定的抑菌作用，不能用此法進(jìn)行這3種中藥的微生物限度的檢查。采用培養(yǎng)基稀釋法對(duì)這3種中成藥的微生物限度檢查，菌回收率均高于70%，因此可以用培養(yǎng)基稀釋法作為復(fù)方丹參片微生物限度檢查的方法。豈春風(fēng)[14]通過(guò)對(duì)護(hù)肝片的微生物限度檢查進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在3次獨(dú)立的平行的試驗(yàn)中，護(hù)肝片細(xì)菌計(jì)數(shù)采用常規(guī)法對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率均低于70%，有顯著的抑菌作用，因此常規(guī)法不適用于護(hù)肝片細(xì)菌的檢查；采用培養(yǎng)基稀釋法，霉菌及酵母菌回收率均高于70%，故可用稀釋法來(lái)檢測(cè)護(hù)肝片中的霉菌及酵母菌；采用離心-薄膜過(guò)濾法則護(hù)肝片中的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌回收率均高于70%，因此可用此方法來(lái)測(cè)定護(hù)肝片中的細(xì)菌數(shù)。

4 袋裝中藥煎煮液的檢查

吳紅宇[15]采用中藥抽出包裝機(jī)對(duì)其醫(yī)院自制制劑消炎利膽一號(hào)在115℃和一定壓力下進(jìn)行密閉煎煮，煎煮液在常溫（20±5）℃和冷藏貯存2種情況下，以時(shí)間為單位，按照衛(wèi)生部1990年版《藥品衛(wèi)生檢查方法》收載的內(nèi)服制劑檢查方法進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)檢查。結(jié)果，煎煮液在常溫下40 d細(xì)菌總數(shù)接近限制值，低溫冷藏在80 d細(xì)菌總數(shù)接近限制值。

5 結(jié)語(yǔ)

上述中藥制劑的微生物限度檢查法已經(jīng)建立，而對(duì)于新的中成藥或者沒(méi)有確定微生物限度檢查法的中成藥，其可能具有抑菌或抗菌作用，因此必須經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)才能確定這些中成藥的微生物限度檢查法。采用常規(guī)法檢驗(yàn)時(shí)，往往造成漏檢或檢查的結(jié)果有差異，為此進(jìn)行藥品檢驗(yàn)前必須采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄏ┰嚻分兴幤烦煞謱?duì)微生物的抗菌或抑菌作用。

由于中成藥是含有多種成分的復(fù)合制劑，具有抑菌作用的中成藥的抑菌作用的強(qiáng)弱可能不同，抑菌活性所采用的方法也不盡相同。因此，各藥品生產(chǎn)企業(yè)和研究單位應(yīng)該根據(jù)中藥制劑自身的特點(diǎn)，在進(jìn)行藥品微生物限度檢查時(shí)，選擇可行的、有效的且操作簡(jiǎn)便、快速的方法。

隨著中藥制劑的不斷發(fā)展，其微生物限度檢查方法也在日益完善?！吨袊?guó)藥典》藥品微生物限度檢查是以劑型為標(biāo)準(zhǔn)，而《美國(guó)藥典》（24版）則是以品種為標(biāo)準(zhǔn)收載。由于中成藥和化學(xué)藥各有特點(diǎn)，其微生物限度檢查法也不能生搬硬套，全部效仿國(guó)外。所以，應(yīng)盡快投入大量的人力、物力，有組織、有步驟地研究，以按照中藥自身的特點(diǎn)以及國(guó)外藥典中的精華部分來(lái)建立中藥制劑微生物限度檢查方法，為人民群眾安全用藥、保證中藥制劑質(zhì)量提供重要的保證。

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