多菌種分段發(fā)酵工藝制備玉米發(fā)酵醬

王斌，黃巧，屈明成，楊莉，趙珠蓮，李洪軍*，李潔，肖琳

1(聚慧食品科技(重慶)有限公司，重慶，401147)2(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)3(重慶食品工業(yè)研究所，重慶，400000)

玉米(ZeamaysL.) 是主要的糧食和能源作物[1]。玉米有著極高的營養(yǎng)價值，其含有64%～78%的淀粉、8%～14%蛋白質(zhì)、3.5%～5.7%脂肪與1.8%～3.5%膳食纖維，此外還含有鈣、鐵、鎂、維生素、亞油酸、谷胱甘肽、酚類化合物等營養(yǎng)保健物質(zhì)，具有明顯的防癌、抗氧化和促消化作用[2]。所以玉米有著延年益壽食品的美稱，在營養(yǎng)高且生物學功能強的食品開發(fā)中具有非常大的潛力[3-4]。

味精和5-核糖核苷酸(如肌苷-5-單磷酸)通常被添加到烹飪產(chǎn)品中增鮮[5]。這些化合物自然存在于許多食物中如曬干的西紅柿、干鰹魚、香菇、海藻或帕爾馬干酪等[6]，當作為純原料添加時，它們有時會引起消費者對增味劑的排斥。如今，由玉米、麥麩和大豆等原料進行發(fā)酵或水解所得的促味劑或調(diào)味劑相繼而出[7]。發(fā)酵食品最終的風味都是由微生物(細菌、真菌和酵母菌)的代謝驅(qū)動，并由順序或伴隨發(fā)生的30多種反應所產(chǎn)生，改變了食物的固有口感、味道，并轉(zhuǎn)化為賦予味道的化合物[6]。盡管代謝途徑中導致味覺化合物產(chǎn)生的機制尚未完全了解，但由于微生物對原料中碳水化合物的消耗分解及其代謝所產(chǎn)生的酶引起的蛋白質(zhì)與多肽的水解是產(chǎn)生味道化合物的主要途徑[8]。

目前關于應用多菌種分段發(fā)酵技術(shù)制備玉米發(fā)酵醬還未見報道，本研究采用分段發(fā)酵法，先接種米根霉菌對玉米進行水解后，以其為原料，選擇植物乳桿菌與希臘魏斯氏菌株作為外加菌種進行發(fā)酵，以期開發(fā)一款天然、營養(yǎng)、健康的酸鮮玉米醬，為玉米醬加工提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料、菌種、培養(yǎng)基與試劑

黃玉米，市售。

希臘魏斯氏菌和米根霉菌株由本實驗室篩選；植物乳桿菌，湖北省工業(yè)微生物菌種保藏與研究中心。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、牛肉膏10、葡萄糖20、K2HPO42、檸檬酸三銨2、乙酸鈉5、吐溫-80 1 mL、MgSO4·7H2O 0.58、MnSO4·4H2O 0.25,pH 6.2～6.4；121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基加入15 g/L瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：稱取去皮土豆200 g，切成小塊，加水1 L，煮沸1 h，雙層紗布過濾澄清液，按蔗糖2%和瓊脂2%(均為質(zhì)量分數(shù))加入濾液中，煮沸溶解后補加蒸發(fā)水分，分裝三角瓶。

蛋白胨、瓊脂，山東拓普生物工程有限公司；酵母提取物、吐溫-80(分析純)，成都市科隆化學品有限公司；牛肉膏、福林試劑、沒食子酸、甲醛，上海麥克林生化科技有限公司；K2HPO4、檸檬酸銨、乙酸鈉、葡萄糖、MgSO4、MnSO4、NaCl(均為分析純)，重慶川東化工集團有限公司。

1.2 儀器與設備

SJ-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設備有限公司；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱、GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；HYQX-II厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；MAS-II plus微波合成萃取反應工作站，上海新儀微波化學科技有限公司；PHS-3C型pH計，上海佑科儀器儀表有限公司；ATY224電子天平，Shimadzu Corporation；DW-HL100超低溫冷凍冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；LDZH-100L立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；純水機，四川優(yōu)普超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細菌菌懸液的制備

米根霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基上35 ℃活化培養(yǎng)96 h，使用0.9%生理鹽水洗脫孢子制備孢子懸浮液，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?；將植物乳桿菌和希臘魏斯氏菌株接種于MRS固體培養(yǎng)基上35 ℃培養(yǎng)24 h，用牙簽取菌體接種于含有100 mL的MRS液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，35 ℃、80 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，直至菌液濃度達到108CFU/mL，備用。

1.3.2 玉米發(fā)酵醬制備

將市售黃玉米去掉玉米芯，用自來水洗凈后，將玉米粒與水以2∶1的質(zhì)量比打漿，121 ℃滅菌15 min，冷卻后備用。

將上述玉米醬300 g置于500 mL滅菌三角瓶中(n=9)，接入6 mL米根霉孢子懸液，使得最后孢子濃度為106個孢子/g玉米醬，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃發(fā)酵3 d。115 ℃滅菌20 min后，3瓶為1組。一組接入6 mL植物乳桿菌；一組接入6 mL希臘魏斯氏菌；一組接入植物乳桿菌與希臘魏斯氏菌各3 mL，置于恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃發(fā)酵。從第1天開始定期取樣，一直取樣至第5天。

1.3.3 微生物分析和pH值測定

將每天取出的樣品用無菌水分別稀釋成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的懸浮液，用移液槍吸取100 μL置于MRS固體平板培養(yǎng)基中，每個梯度懸浮液重復3次，混合均勻后，翻轉(zhuǎn)平板，置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，菌落計數(shù)，每個平板中的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每個發(fā)酵時間點的菌落總數(shù)(參考GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》)。將每天取出的樣品用pH計測定pH值[9]。

1.3.4 還原糖含量的測定

采用快速直接滴定法測定樣品中的還原糖含量[10]。

1.3.5 總酸含量的測定

采用滴定法[11]測定樣品中總酸含量，以乳酸計。

1.3.6 總酚含量的測定

樣品中總酚測定采用Folin-Ciocalteu法[12]，稍加改進。稱取1 g發(fā)酵樣品，溶于9 mL的80%(體積分數(shù))乙醇中。用移液槍吸取上述待測樣品0.5 mL置于10 mL具塞比色管中，加入0.5 mL去離子水，搖勻后加入0.5 mL福林試劑，混勻，1 min后加入1.5 mL的20%(質(zhì)量分數(shù))NaCO3溶液，混合均勻，用去離子水定容至10 mL，放于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，冷卻后于紫外分光光度計中765 nm下測定OD值。以沒食子酸為標準品進行比對。

1.3.7 氨基酸態(tài)氮含量的測定

采用甲醛滴定法[12]測定樣品中的氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.8 感官評價

對發(fā)酵結(jié)束后的玉米醬樣品進行了消費者可接受性測試，感官評定主要參照肖欣欣[13]的方法，采取十分制，評分強度0～9(0：無；1～2：非常弱；3～4：普通；5～6：較好；7～8：好；9：很好)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米醬后發(fā)酵過程中微生物與pH變化

在玉米醬后發(fā)酵過程中，所有樣品中的乳酸菌菌落總數(shù)在1 d內(nèi)迅速增加。初期單獨接種希臘魏斯氏菌的菌落總數(shù)高于單獨接種植物乳桿菌；接種2種菌劑的菌落總數(shù)明顯高于二者單獨接種(圖1-a)。植物乳桿菌是典型的同型乳酸菌，希臘魏斯氏菌是異型乳酸菌，在蔬菜發(fā)酵初期，異型乳酸菌能夠快速啟動發(fā)酵[14]，其繁殖速度非?？?，所以單獨接種希臘魏斯氏菌的活菌數(shù)迅速增長，但隨著發(fā)酵的進行，由于異型乳酸菌希臘魏斯氏菌不耐酸，其乳酸菌數(shù)量又迅速減少。植物乳桿菌本身就是耐酸能力較強的同型乳酸菌，所以在接種中后期，植物乳桿菌乳酸菌含量都要高于單獨接種希臘魏斯氏菌組。異型乳酸菌在發(fā)酵代謝中可以提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進植物乳桿菌的繁殖[15]，因此接種2種菌劑的菌落總數(shù)不會隨著體系中希臘魏斯氏菌數(shù)量的減少而減少，反而是維持在一定范圍內(nèi)，直至發(fā)酵結(jié)束。

在發(fā)酵過程中，3種不同菌劑發(fā)酵玉米醬的pH值在發(fā)酵前2 d呈快速下降趨勢，然后緩慢下降，直至穩(wěn)定，說明植物乳桿菌和希臘魏斯氏菌可以利用玉米醬中的營養(yǎng)物質(zhì)生長，同時產(chǎn)生酸性代謝物質(zhì)，促使環(huán)境pH值隨著發(fā)酵的進行不斷降低。其中，接種2種菌劑的玉米醬比單獨接種的玉米醬pH下降的程度要大(圖1-b)，說明同型乳酸菌與異型乳酸菌的協(xié)同作用可以改變發(fā)酵條件，增加玉米醬的酸化程度。

a-菌落總數(shù)；b-pH圖1 玉米后發(fā)酵過程中菌落總數(shù)和pH值變化Fig.1 Changes in total bacterial count and pH value during post-fermentation of corn注：不同小寫英文字母表示組間顯著差異(P<0.05)(下同)

2.2 玉米醬后發(fā)酵過程中還原糖含量變化

玉米中可用于發(fā)酵的游離糖含量很少[16]，但含有較高的淀粉[17]，于是本研究在實驗前期使用米根霉先發(fā)酵水解3 d，米根霉菌絲體在生長過程中可以通過淀粉酶將玉米中的淀粉分解為還原糖，還原糖含量由未發(fā)酵的0.878 mg/g增加到了12.87 mg/g。在后發(fā)酵過程中，3種不同菌劑發(fā)酵的玉米醬中還原糖含量都不斷下降，其中，接種植物乳桿菌后，還原糖含量降低了77.69%；接種希臘魏斯氏菌后，還原糖含量降低了73.24%；接種2種菌劑后還原糖含量降低了89.66%，如圖2所示。米根霉水解后，玉米中的碳源十分利于2種菌劑的定殖，被其發(fā)酵利用。

圖2 玉米后發(fā)酵過程中還原糖變化Fig.2 Changes of reducing sugar during post-fermentation of corn

2.3 玉米醬后發(fā)酵過程中總酸含量變化

由圖3可知，單獨接種希臘魏斯氏菌的玉米醬中總酸含量要低于單獨接種植物乳桿菌組，這可能是因為希臘魏斯氏菌的產(chǎn)酸能力較弱。接種2種菌劑的玉米醬中的總酸含量高于其他2組，異型乳酸菌希臘魏斯氏菌雖然產(chǎn)酸能力較弱，但其代謝活動會促進植物乳桿菌的生長繁殖與乳酸代謝，因此乳酸含量高。隨著體系中可發(fā)酵的糖類物質(zhì)不斷被消耗，乳酸含量不斷升高，最后又呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的其他代謝物質(zhì)，如乙醇等，會使乳酸在酯化作用下形成酯香類物質(zhì)，因此乳酸量會相應減少。

圖3 玉米后發(fā)酵過程中總酸含量變化Fig.3 Changes of total acid during post-fermentation of corn

2.4 玉米醬后發(fā)酵過程中總酚含量變化

酚酸會通過酚環(huán)上或者分子結(jié)構(gòu)上的羧基與其他聚合物發(fā)生酯化反應，變?yōu)椴豢扇芪镔|(zhì)，而發(fā)酵可以充分利用微生物所產(chǎn)生的酶斷開此鏈，釋放出酚酸[18]，使總酚含量得以提高。由于菌種的不同，酶的數(shù)量與活性也不同，所以不同菌劑發(fā)酵的玉米醬中總酚含量增長不同。在后發(fā)酵第4天時，3種不同菌劑發(fā)酵的玉米醬中的總酚含量都增長到最高值，其中，接種植物乳桿菌組的總酚含量為第0天的4.34倍；希臘魏斯氏菌組為1.48倍；2種菌劑組為5.05倍(圖4)。

圖4 玉米后發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.4 Changes of total phenols during post-fermentation of corn

2.5 玉米醬后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化

由圖5可以看出，玉米醬中氨基酸態(tài)氮含量隨著后發(fā)酵時間的延長呈現(xiàn)逐步增加的趨勢，到第4天時，3種不同菌劑發(fā)酵的玉米醬中的氨基酸態(tài)氮含量均達到最高，與第0天時相比，單獨接種植物乳桿菌組的氨基酸態(tài)氮提高了2.54倍；單獨接種希臘魏斯氏菌組的氨基酸態(tài)氮提高了2.20倍；接種2種菌劑組的氨基酸態(tài)氮提高了3.04倍。進一步延長發(fā)酵時間，氨基酸態(tài)氮的含量緩慢下降，這可能是因為前期微生物所分泌的蛋白酶非常活躍，其分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸的速度就快[19]，隨著發(fā)酵的進行，體系中會不斷生成乙醇等物質(zhì)，高濃度的乙醇量會抑制蛋白酶活力，此外，氨基酸也會參與到一些生理生化反應中，所以氨基酸總量會不斷減少。

圖5 玉米后發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量變化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen during post-fermentation of corn

2.6 玉米發(fā)酵醬感官品質(zhì)評價

對玉米后發(fā)酵第4天的3組樣品進行感官分析，評價其感官品質(zhì)。圖6表明，接種2種菌劑發(fā)酵的玉米醬，盡管其色澤的分數(shù)低于單獨接種植物乳桿菌與希臘魏斯氏菌的玉米醬，但其具有明顯成熟玉米發(fā)酵的柔和、酸鮮和回甘滋味，其酸度、形態(tài)、鮮味、玉米香味和復合香味方面都要優(yōu)于其他2組。希臘魏斯氏菌經(jīng)過戊糖磷酸途徑發(fā)酵后除主要產(chǎn)乳酸外還可以產(chǎn)生大量乙酸、乙醇與甘露醇等風味物質(zhì)，具有產(chǎn)物多樣性的特點，可以賦予產(chǎn)品更好的風味[20]。其協(xié)同同型乳酸發(fā)酵菌植物乳桿菌可明顯改善2種菌劑單獨接種發(fā)酵玉米醬風味貧乏的缺點。

圖6 玉米發(fā)酵醬感官品質(zhì)評價Fig.6 Sensory characteristics of corn fermented sauce

3 結(jié)論

本文使用分段發(fā)酵技術(shù)充分利用玉米原料中各組分，促進糖類、酚類、有機酸與氨基酸態(tài)氮等風味物質(zhì)的釋放，增加產(chǎn)物的酸鮮底蘊。實驗證明，利用米根霉將玉米中淀粉降解為多糖后，有利于植物乳桿菌、希臘魏斯氏菌進行乳酸發(fā)酵，并且植物乳桿菌和希臘魏斯氏菌混合發(fā)酵效果明顯高于單獨用1種菌發(fā)酵的效果。混合發(fā)酵第4天時，玉米醬中的還原糖含量最低，總酸、總酚、氨基酸態(tài)氮以及感官評價分數(shù)最高，玉米醬的品質(zhì)最好。多菌種分段式發(fā)酵工藝是未來玉米醬加工的必然趨勢，本研究的試驗結(jié)果為制備玉米發(fā)酵醬提供了新的方法。