線粒體 DNA突變與衰老

李豪杰 代會瑩 扈 盛 胡亞哲

(華中師范大學(xué)體育學(xué)院,湖北 武漢 430079)

衰老又稱老化,通常是指在正常狀況下生物發(fā)育成熟后,隨年齡增加,自身功能減退,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定能力與應(yīng)激能力下降,結(jié)構(gòu)、組分逐步退行性改變,趨向死亡,不可逆轉(zhuǎn)的現(xiàn)象〔1〕。1956年,Harman首先提出來衰老的自由基假說,之后又提出人類衰老過程中線粒體 DNA是自由基攻擊的首要目標(biāo)。19世紀(jì)80年代初 Miquel等提出“細(xì)胞衰老學(xué)說”,認(rèn)為衰老是由于氧自由基攻擊線粒體DNA引起的一個生物過程。1989年 Linnane等提出線粒體衰老假說。隨著時代的發(fā)展與科技的進(jìn)步,人們越來越關(guān)注線粒體與衰老的關(guān)系,線粒體與衰老的關(guān)系也成為研究前沿。

1 線粒體DNA的生物學(xué)特征

1.1 線粒體DNA的結(jié)構(gòu) 1963年Nass通過雞胚實驗研究發(fā)現(xiàn)線粒體中含有核糖核酸類物質(zhì)——DNA;1981年 Anderson檢測了人類 mtDNA分子序列;同年,Bibb等完成對大鼠 mtDNA測序。人類 mtDNA分子長度為 16 569 bp,是閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu),其外環(huán)因含鳥嘌呤較多、胞嘧啶較少而分子量較多稱為重鏈(H),內(nèi)環(huán)因含胞嘧啶較多、鳥嘌呤較少而分子質(zhì)量較小稱為輕鏈(L)。除有 1個與 DNA復(fù)制起始有關(guān)的 8 bp的 D環(huán)(D-Loop)外,其他均沒有內(nèi)含子。人類 mtDNA有 37個編碼基因,分別是 22個 tRNA基因,2個 rRNA基因和 13個蛋白質(zhì)基因。蛋白質(zhì)基因分別為 1個編碼復(fù)合體Ⅲ細(xì)胞色素 b氧化酶基因,2個編碼復(fù)合體Ⅴ的 ATP酶亞單位 6和 8基因,3個編碼復(fù)合體Ⅳ的細(xì)胞色素c氧化酶亞單位基因和 7個編碼復(fù)合體Ⅰ呼吸鏈煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)脫氫酶亞單位基因。2個 rRNA基因(12 S、16 S)和 22個 tRNA基因位于 D環(huán)之后,各基因之間沒有間隔區(qū),即 1個基因的最后一個堿基與相鄰的基因第一個堿基相鄰,甚至出現(xiàn)重疊現(xiàn)象〔2〕。

1.2 線粒體DNA的遺傳特點 ①母系遺傳:1980年 Giles等對幾個歐洲家系線粒體基因進(jìn)行了單核苷酸多態(tài)性分析,發(fā)現(xiàn)mtDNA分子嚴(yán)格按照母系遺傳方式進(jìn)行傳遞。母系遺傳是指只有母親能將其mtDNA分子傳遞給下一代,然后通過女兒傳播給后代。②異質(zhì)性和突變負(fù)荷:線粒體基因突變可發(fā)生在成千上萬個 mtDNA分子上,由此產(chǎn)生了突變量介于 0到 100%之間的 mtDNA突變體。人們將細(xì)胞或組織同時擁有突變型和野生型 mtDNA的狀態(tài)稱為異質(zhì)性;將細(xì)胞或組織只擁有一種mtDNA的狀態(tài)稱為均質(zhì)性〔3〕。異質(zhì)性可分成長度異質(zhì)性和位點異質(zhì)性兩類。長度異質(zhì)性的大多數(shù)情形是線粒體基因組的某一段,主要是D環(huán)區(qū)的串聯(lián)重復(fù),現(xiàn)存的長度異質(zhì)性多被認(rèn)為是中性選擇的結(jié)果〔4〕。位點異質(zhì)性表現(xiàn)在一個或多個核苷酸位點上不同的 mtDNA,即主要是由于DNA上某個或數(shù)個堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入或缺失等點突變所產(chǎn)生的,引起個體內(nèi)的mtDNA異質(zhì)性〔5〕。突變負(fù)荷是指發(fā)生突變的 mtDNA占全體mtDNA的百分比,它是衡量 mtDNA突變體異質(zhì)性程度的重要指標(biāo)。③閾值效應(yīng):當(dāng)異質(zhì)性 mtDNA突變體的突變負(fù)荷較低時,與突變型mtDNA共存的野生型 mtDNA會發(fā)揮足夠的補償作用,以維持線粒體呼吸鏈的功能。然而,當(dāng)突變負(fù)荷超過一定范圍,使得野生型mtDNA的數(shù)量不足以維持呼吸鏈的功能時,組織或器官就會出現(xiàn)異常,這種現(xiàn)象被稱為閾值效應(yīng)。④“瓶頸”和隨機分配:異質(zhì)性 mtDNA突變體的突變負(fù)荷高低在不同的世代交替間變化顯著,這種效應(yīng)稱為線粒體遺傳的“瓶頸”〔6〕。每個卵母細(xì)胞有數(shù)千個至上萬個 mtDNA拷貝,但只有2～200個可以傳遞給子代,這一過程中mtDNA拷貝數(shù)目成倍減少。瓶頸效應(yīng)發(fā)生的時間不同,mtDNA數(shù)目和種類的削減程度也不同。在有絲分裂時,mtDNA被隨機分配到子代細(xì)胞中。

2 衰老的生物學(xué)特征

衰老是從性成熟后才開始或加速的一種帶普遍性、漸進(jìn)性且不可逆轉(zhuǎn)的生命過程,其表現(xiàn)在物種的整體、器官與組織、細(xì)胞與分子等各個水平。一般說來,線粒體數(shù)量隨年齡而減少。對老年小鼠下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的觀察發(fā)現(xiàn):在正常情況下線粒體數(shù)量無年齡差異,但老年小鼠在滲透負(fù)荷的應(yīng)激狀態(tài)下,線粒體數(shù)量大量減少。形態(tài)學(xué)上可見老年機體內(nèi)線粒體常增大變形,嵴與基質(zhì)減少或出現(xiàn)空泡。錢杰等〔7〕通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn):衰老小鼠心肌組織中可見線粒體數(shù)目少、排列紊亂、線粒體肥大、腫脹,畸形較多,外膜、嵴部分消失。一般認(rèn)為隨年齡的增加,mtDNA的相對數(shù)量會增加。王學(xué)波等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)外周血單個細(xì)胞的線粒體 DNA含量隨年齡增加而增多;Lee等〔9〕通過對 49例年齡為 16～85歲的健康人研究也發(fā)現(xiàn):80歲以上的人肺 mtDNA的數(shù)量比 20歲以下的約高 2～6倍,認(rèn)為這可能是衰老時肺功能下降的一種補償機制。目前關(guān)于 mtDNA含量增加的機制尚不完全清楚,可能的機制報道較多的主要有:①代謝反饋機制,認(rèn)為衰老時,線粒體一方面通過增加未受損的正常線粒體的工作量來代償,一方面通過增加線粒體的數(shù)量來代償。②快速復(fù)制機制,較正常mtDNA短而有缺失的mtDNA,具有復(fù)制的優(yōu)勢性,造成細(xì)胞內(nèi)大量無功能的 mtDNA的堆積。③調(diào)節(jié)失控機制,野生型 mtDNA的控制作用因基因突變而抑制或失活,突變型DNA的量就超過野生型,導(dǎo)致與細(xì)胞能量狀態(tài)及代謝需要無關(guān)的突變型mtDNA的堆積。

3 線粒體DNA突變與衰老

3.1 線粒體DNA的易受損性和突變原因

3.1.1 線粒體DNA的易受損性 線粒體 DNA易受損性和突變是與其結(jié)構(gòu)、遺傳特點密切相關(guān)的。線粒體DNA分子上為核苷酸結(jié)合蛋白,缺少組蛋白的保護(hù),而且線粒體內(nèi)沒有 DNA損傷修復(fù)系統(tǒng),這就導(dǎo)致了 mtDNA容易突變〔10〕。具體地說,mtDNA幾乎不受DNA結(jié)合蛋白的保護(hù),即裸露在線粒體內(nèi)部,易受外界因素的干擾;線粒體內(nèi)脂肪/DNA的比值很高,使具有嗜酸性的致癌物質(zhì)優(yōu)先在 mtDNA上聚集;mtDNA在整個細(xì)胞中一直處于不停的合成狀態(tài);線粒體是細(xì)胞的動力工廠,氧濃度較高,且易產(chǎn)生氧自由基及過氧化氫等活性氧族,自身又缺乏有效的清除系統(tǒng),故 mtDNA易受活性氧損傷〔11〕;mtDNA在復(fù)制時由于 mtDNA多聚酶 γ的校對性差,以及 tRNA基因部位易形成發(fā)夾樣結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其復(fù)制錯配率明顯高于核 DNA〔12〕。

3.1.2 線粒體DNA的突變原因 目前認(rèn)為,活性氧在細(xì)胞體內(nèi)堆積造成的損傷是衰老時線粒體DNA突變的主要原因〔12〕。對培養(yǎng)的細(xì)胞,給予氧化應(yīng)激,產(chǎn)生過多的活性氧后,對線粒體DNA的損害程度遠(yuǎn)比核 DNA高,而且持續(xù)的時間長。Ozawa〔13〕的研究表明:線粒體內(nèi)的活性氧可造成 mtDNA的斷裂、能源危機、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞萎縮及點突變和缺失。Adachi等〔14〕觀察到適當(dāng)補充輔酶 Q10可以阻止 mtDNA的缺失,降低心肌線粒體脂質(zhì)過氧化水平。這直接證明了活性氧與 mtDNA突變有直接的關(guān)系。研究表明,mtDNA缺失與 8-羥基-脫氧鳥苷酸(8-OH-d G)的含量呈明顯相關(guān)性〔13〕。 Lezza〔15〕等通過對 6名健康老人和 7名患 Alzheimer病的老人實驗研究顯示:健康老人體內(nèi) mtDNA 4 977 bp的缺失與 8-OH-dG的數(shù)量呈明顯的正相關(guān),相反,患 Alzheimer病的老人卻沒有出現(xiàn)相關(guān)性。認(rèn)為此現(xiàn)象是因為 mtDNA內(nèi)過多的自由基導(dǎo)致 mtDNA雙鏈的分解,將有助于DNA復(fù)制過程中缺失突變的發(fā)生。有兩種主要的mtDNA復(fù)制模型:線性異步復(fù)制模型和后隨鏈復(fù)制模型〔16〕。這兩種模型認(rèn)為 mtDNA缺失是由于 mtDNA復(fù)制錯誤而引起的。大多數(shù)報道的 mtDNA缺失是憑借一種滑動復(fù)制機制發(fā)生在主要弧區(qū),但這種機制絕大程度上認(rèn)為 mtDNA是異步復(fù)制,因為該理論認(rèn)為線粒體內(nèi)大部分是單線型DNA。不過最近的研究認(rèn)為大部分的單線型 DNA是不存在的,并且在一定程度上后隨鏈模板受 RNA保護(hù)。Nishigaki〔17〕等通過 36例病人組織和細(xì)胞的點突變研究發(fā)現(xiàn):有 31例點突變是T-C的轉(zhuǎn)化,同時還檢測出一個單堿基對的普通缺失和一個TT-AA的點突變。這一實驗結(jié)果首次證實了腺苷的代謝作用會誘發(fā)多種序列點突變。其潛在的機制是:胸苷磷酸化酶的缺乏,增加了脫氧胸苷和嘧啶的數(shù)量導(dǎo)致線粒體核苷酸庫的不平衡,由此導(dǎo)致mtDNA的畸形,進(jìn)而產(chǎn)生突變。 David〔18〕等通過對 263例人類不同的 mtDNA缺失研究表明:mtDNA缺失突變的發(fā)生與野生型mtDNA的基本特征沒有相關(guān)性,但是與核苷酸 8470和 13447的兩個位點 13-bp的重復(fù)有著顯著的相關(guān)性。大多數(shù)的mtDNA缺失的出現(xiàn)都與這兩個位點的重復(fù)有關(guān),暗示mtDNA的普通缺失與 mtDNA的復(fù)制有關(guān)。mtDNA聚合酶(Pol-r)是僅位于線粒體的酶而且是 DNA靶子,被認(rèn)為是 mtDNA合成的主要原因,包括線粒體基因的復(fù)制和 DNA損傷的修復(fù),Trifunovic等〔19〕研究認(rèn)為 Pol-r引起 mtDNA突變的潛在機制是:Pol-r能引起線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)功能異常而造成氧耦合缺陷使 ATP消耗增加導(dǎo)致活性氧族生成增多,引起 mtDNA損傷和突變。Krishnan〔20〕研究認(rèn)為:mtDNA的缺失發(fā)生在對損傷 mtDNA修復(fù)過程中,起始單鏈區(qū)mtDNA缺失是因 mtDNA在雙鏈解旋過程中核酸外切酶活動引起。增加抗氧化劑和清除氧自由基的物質(zhì)能夠阻止雙鏈 DNA斷裂(DSBs)的產(chǎn)生,因此也就阻止 mtDNA缺失。

3.2 與衰老相關(guān)的線粒體DNA突變 1988年 Holt等人首次證實了線粒體病與線粒體突變之間的關(guān)系?，F(xiàn)已證實多種與衰老相關(guān)的退行性疾病都與mtDNA突變有關(guān),諸如早老性癡呆、帕金森綜合征、肌萎縮運動型神經(jīng)障礙等都是由于 mtDNA突變引起的神經(jīng)系統(tǒng)或肌肉組織病變。目前已證實至少 5種mtDNA突變與衰老有關(guān):①mtDNA的缺失;②點突變;③插入;④串聯(lián)重復(fù);⑤DNA重排。至今,已有 250多種 mtDNA點突變和不計其數(shù)的mtDNA重組突變被報道與人類疾病相關(guān),與衰老相關(guān)的 mtDNA突變主要是缺失、點突變和重排。

3.2.1 線粒體DNA缺失突變與衰老 與衰老相關(guān)的 mtDNA缺失最早見于 Lkebe等對帕金森病患者腦組織 mtDNA缺失的研究中,所有的患者都檢測到 4 977 bp缺失。之后又發(fā)現(xiàn)缺失存在于人的心肌、骨骼肌、肝、腎等多種組織和細(xì)胞中。從病理分類,主要有兩類缺失:單個缺失和多重缺失〔21〕。單個缺失的分子數(shù)量常占總線粒體 DNA的 20%～80%,多重缺失常見于組織的正常衰老過程。曾昭惠等〔22〕對小鼠衰老和缺血時腦細(xì)胞線粒體 DNA片段缺失的研究表明:老年鼠大腦細(xì)胞中mtDNA有片段缺失,中青年鼠無缺失現(xiàn)象;缺血可導(dǎo)致鼠腦細(xì)胞mtDNA片段缺失,但老年鼠更加明顯。初步證實了 mtDNA片段的缺失與增齡有關(guān)。吳曉晶等〔23〕采用 Southern雜交及聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法對 48例不同年齡組人白細(xì)胞進(jìn)行線粒體DNA缺失的分析表明:線粒體DNA缺失發(fā)生率及相對含量均隨增齡而增加?，F(xiàn)階段研究較多的是線粒體 DNA 4 977 bp的缺失(大鼠對應(yīng)的是 4 834bp缺失),在體內(nèi)多個組織中可檢測出此缺失,故此缺失又叫做共同缺失。Meissner〔24〕等采用 PCR檢測法對 92名被試的大腦內(nèi)的黑質(zhì)、尾狀核、殼核、額葉、小腦及右心室、左心室和髂腰肌的線粒體 DNA進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)在mtDNA的 123位點出現(xiàn) 4 977 bp的缺失,并且所有的缺失都與增齡出現(xiàn)極其顯著的正相關(guān)。

3.2.2 線粒體DNA點突變與衰老 mtDNA的點突變可分為tRNA的點突變和編碼蛋白基因的點突變。tRNA的點突變常見于線粒體 RNA基因上 3 243位點的 A突變成G,該突變可阻礙 mtDNA編碼的蛋白質(zhì)合成,并可導(dǎo)致 rRNA轉(zhuǎn)錄終止,多見于線粒體神經(jīng)肌肉性疾病。16例少年 mtDNA的觀察表明:tRNA的點突變可在成年衰老組織中檢測出而在少年組織中未發(fā)現(xiàn),并且該突變隨年齡的增加而呈現(xiàn)積累趨勢。

3.2.3 線粒體DNA重排與衰老 Wallace等曾報道隨年齡的變化線粒體氧化磷酸化能力下降是由于mtDNA重排的積累引起的。隨后的研究中,通過聚合酶鏈反應(yīng)在衰老的骨骼肌及腦組織中也發(fā)現(xiàn)了 mtDNA重排,推測 mtDNA的重排與衰老有關(guān)。Coskum等〔25〕對人類線粒體的遺傳特性研究的時候發(fā)現(xiàn):有絲分裂后組織中 mtDNA重排隨年齡積累,這個年齡點一般是 45歲左右。Chinnery等〔26〕通過對健康老人大腦組織中mtDNA控制區(qū)的研究發(fā)現(xiàn),在多個組織中都發(fā)現(xiàn)不同的 mtDNA重排隨衰老積累,但是并沒發(fā)現(xiàn)點突變有明顯的積累。線粒體DNA突變隨年齡的增加而積累,達(dá)到一定閾值后,可導(dǎo)致細(xì)胞能量危機,從而造成機體生理功能的減退引起衰老。

4 線粒體DNA突變在線粒體功能下降和衰老中的作用

1989年Linnane等提出的線粒體衰老學(xué)說認(rèn)為mtDNA由于線粒體的結(jié)構(gòu)特點容易受到自由基的攻擊,引發(fā) mtDNA的氧化損傷,導(dǎo)致 mtDNA突變。mtDNA的突變進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體呼吸鏈電子傳遞泄漏,使自由基生成增加,進(jìn)而導(dǎo)致 mtDNA突變增加,以致形成惡性循環(huán)。Linnane等認(rèn)為這種惡性循環(huán)導(dǎo)致衰老時生理功能衰退,而 mtDNA突變在其中起到核心的作用。Kovalenko〔27〕等人采用 KL-PCR擴增老年受試者三角肌mtDNA全長,來評估m(xù)tDNA的完整性。結(jié)果顯示突變廣泛發(fā)生,90歲受試者肌肉組織中只有不到 5%的 mtDNA仍是完整的,大部分mtDNA都存在著缺失突變或 mtDNA的重排。他們認(rèn)為 mtDNA嚴(yán)重?fù)p傷必將影響線粒體蛋白質(zhì)的合成能力。Michikawa〔28〕等人的研究為“衰老的線粒體理論”提供了有力的證據(jù)。他們發(fā)現(xiàn) mtDNA突變隨年齡而積累,而且突變主要發(fā)生在控制線粒體基因組復(fù)制到 D環(huán)區(qū)。研究發(fā)現(xiàn)老年 mtDNA D環(huán)區(qū)存在高頻的點突變,而年輕人則沒有。這些突變可能導(dǎo)致與衰老有關(guān)的損傷作用的自由基產(chǎn)生增多,導(dǎo)致線粒體能力產(chǎn)生不足。加速 mtDNA的突變率會導(dǎo)致機體的過早衰老,同時會伴隨線粒體功能的喪失——衰老發(fā)生的主要因素〔29〕。

總之,線粒體在衰老中的作用毋庸置疑,但是否因 mtDNA突變引起線粒體衰老還存在爭議,而且該機制還不清楚。此外,mtDNA的缺失和點突變、重排等達(dá)到什么樣的臨界閾值影響線粒體的功能?mtDNA缺失對線粒體呼吸鏈電子傳遞復(fù)合體的活性隨增齡而起多大的作用?機體自身的衰老過程對線粒體呼吸鏈電子傳遞有多大程度的影響?這些值得探討的問題將有助于對 mtDNA在衰老中的作用機制,以及在運動延緩衰老中的有更深刻的理解。

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