組織和細(xì)胞中Ca2+濃度測定方法的研究進(jìn)展

邊 原，肖洪濤，陳 璐

Ca2+在人體內(nèi)不但具有重要的生理作用，在組織或細(xì)胞產(chǎn)生病理反應(yīng)時其濃度還能反映病灶的病變程度，它作為細(xì)胞內(nèi)的信息傳遞物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、參與信號跨膜傳遞以及介導(dǎo)細(xì)胞對外界刺激的應(yīng)答反應(yīng)等重要作用［1］。因此，組織或細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測定方法的研究和改進(jìn)，對臨床和藥學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究具有重要的意義［2］。

1 45Ca 跨膜流動測定方法

同位素45Ca(T0.5=163 d，β射線能量為0.25 MeV)與生物體中的Ca2+具有相同的生物活性，由于45Ca發(fā)出的β射線能被探測，因此只要測量45Ca進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的數(shù)量變化就可快速、直觀地反映出藥物對Ca2+通道的阻滯特性。平滑肌細(xì)胞膜上一般存在有3種Ca2+通道:① 靜流鈣通道;②受體鈣通道;③電壓依賴鈣通道。欲真實(shí)測量通過每一種鈣通道進(jìn)入細(xì)胞中45Ca的量，必須除掉在細(xì)胞膜外面的全部45Ca。該法采用冷EGTA絡(luò)和法測量45Ca進(jìn)人細(xì)胞的量，既能除去細(xì)胞外的45Ca2+，又能確保已進(jìn)人細(xì)胞中的45Ca2+不重新流出細(xì)胞外。國內(nèi)有研究者［3-4］將此方法用于動物組織包括心肌、主動脈等所含的Ca2+進(jìn)行測定，效果較好，同時為中藥對鈣通道的影響提供了較好的方法，具有用樣少、操作簡便、快速靈敏、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。

2 X射線微區(qū)分析方法

X射線微區(qū)分析技術(shù)利用電子束轟擊樣品，產(chǎn)生特征X射線。特征X射線是入射電子激發(fā)外層電子釋放的，其能量和波長為每種離子所固有，通過這種特性就有可能進(jìn)行元素定性分析，進(jìn)行定量分析的基礎(chǔ)在于特征X射線的強(qiáng)度與樣品中所含元素的濃度有關(guān)。目前X射線微區(qū)分析技術(shù)能夠成功地用于測量細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器所含的Ca2+濃度［5］。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣庫具有非均勻性。研究者通過電刺激海馬神經(jīng)元樹突發(fā)現(xiàn)一些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊狀結(jié)構(gòu)的Ca2+濃度出現(xiàn)非常強(qiáng)勁的增長，同時其它一些囊狀結(jié)構(gòu)卻沒有應(yīng)答反應(yīng)［6］。目前此研究法在形態(tài)學(xué)識別細(xì)胞器內(nèi)Ca2+濃度方面具有最高的分辨率。

3 離子選擇微電極方法

離子選擇性微電極(ISME)是一種能測定細(xì)胞等生物微環(huán)境內(nèi)單一離子活度的信息傳感器，其主要特點(diǎn)是微型化，尖徑在1 μm內(nèi)，能在不損傷細(xì)胞的情況下，直接插入單個細(xì)胞內(nèi)，運(yùn)用電位測定法測定細(xì)胞內(nèi)的離子濃度。所以IMSE對研究細(xì)胞的生理功能十分重要，目前廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、臨床檢驗(yàn)和藥物分析等。楊紅蕓等［7］利用自制Ca2+選擇性微電極建立血清樣品中Ca2+測定方法，研究結(jié)果表明Ca2+-ISME可用于內(nèi)源性藥物鈣制劑的藥物代謝動力學(xué)研究。

4 核磁共振波譜方法

核磁共振(NMR)波譜方法是無損傷研究生物樣本的重要手段，能夠在接近生物樣本生理狀態(tài)下連續(xù)動態(tài)地進(jìn)行檢測［8］。19FNMR是細(xì)胞內(nèi)Ca2+測定的非光學(xué)方法，由于正常生物體內(nèi)含氟成分少，為了得到足夠的響應(yīng)，在檢測游離Ca2+濃度時使用含氟指示劑，目前常用的指示劑為nF-BAPTA［n fluoro-1，2-bis(2-aminophenoxy)ethane-N，N，N′，N′tetraacetic acid］衍生物。nF-BAPTA需經(jīng)過乙酰氧甲酯的化學(xué)修飾(nF-BAPTA-AM)才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，之后水解成為游離酸形式，與細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+結(jié)合形成螯合物Ca2+-nF-BAPTA。根據(jù)所形成的螯合物解離常數(shù)(Kd)不同，可分為快交換型5F-BAPTA和慢交換型4F-BAPTA。用核磁共振檢測快交換型的5F-BAPTA在NMR波譜圖上得到其結(jié)合和未結(jié)合Ca2+型2個峰，由兩峰的峰面積比和Kd，可計(jì)算細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度;對于慢交換型的4F-BAPTA會出現(xiàn)單峰，利用結(jié)合與未結(jié)合Ca2+型的化學(xué)位移計(jì)算Ca2+濃度［9］。

5 原子吸收分光光度法測定方法

原子在一般情況下處于能量最低狀態(tài)(基態(tài))。當(dāng)原子吸收外界能量被激發(fā)時，其最外層電子可躍遷到較高的不同能級上(激發(fā)態(tài))。處于激發(fā)態(tài)的電子很不穩(wěn)定，一般在極短的時間便躍回基態(tài)，此時原子以電磁波的形式放出能量。原子吸收分光光度法是基于光源輻射出具有待測元素特征波長的光通過試樣原子蒸氣時，被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子所吸收，然后利用光被吸收的程度來測定待測元素的含量。它具有測定靈敏度高、檢出限小、干擾少、操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)。毛亞倫等［10］利用原子吸收分光光度法、熒光指示劑法以及細(xì)胞膜酶活性法研究感染嚴(yán)重程度與紅細(xì)胞膜鈣泵、細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度關(guān)系，結(jié)果表明感染患者存在細(xì)胞外Ca2+向細(xì)胞內(nèi)流動，導(dǎo)致細(xì)胞功能紊亂、損害甚至死亡。

6 熒光指示劑測定方法

熒光指示劑測定法是用具有特異性與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合的熒光探針或染料，以其與鈣離子結(jié)合后熒光強(qiáng)度所發(fā)生改變通過成像、激光共聚焦顯微技術(shù)等測算細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的一種方法，目前應(yīng)用較為廣泛，常用于測定細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器Ca2+含量。

6.1 線粒體中［Ca2+］的測量 目前線粒體中Ca2+濃度的測量最廣泛應(yīng)用的熒光指示劑為Rhod-2。在乙酰氧甲酯的作用下，Rhod-2帶有的正電荷，可使該指示劑在線粒體中優(yōu)先累積。經(jīng)脫酯后指示劑散落在線粒體中，并且在線粒體囊腔中顯示 Ca2+濃度［11］。

Rizzuto等［12］首先成功的將生物發(fā)光蛋白-水母熒光素定位線粒體中的Ca2+。利用定位線粒體Ca2+的指示劑發(fā)現(xiàn)在血管壁內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)存在大量的Ca2+，并且線粒體Ca2+的濃度迅速發(fā)生變化定位線粒體外葉的水母熒光素顯示，在以肌醇三磷酸(IP3)介導(dǎo)的從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的Ca2+過程中，線粒體比其它細(xì)胞器更易于接收到較高的Ca2+信號［13］。Montero等［14］使用與線粒體內(nèi)Ca2+具有不同親合性的水母熒光素，并和不同類型的熒光素發(fā)光底物腔腸素重新組合，能夠擴(kuò)大Ca2+濃度測定的線性范圍。近年來，科學(xué)家開始用人工熒光蛋白cameleon、pericam以及camgaroo等來進(jìn)行Ca2+的濃度測量。此類研究方法以相應(yīng)的cameleon為基礎(chǔ)表現(xiàn)出線粒體指示劑的定位以及對Ca2+的敏感程度。此外該研究還使用新型工藝，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)產(chǎn)生有關(guān)Ca2+循環(huán)的在概念方面的重要消息［15］。Rodolf等［16］在生理?xiàng)l件下用指示劑cameleon對骨骼肌中的Ca2+進(jìn)行測量，此方法使用了雙光子顯微技術(shù)，解決了線粒體中Ca2+濃度迅速變化而測定不準(zhǔn)的問題，并具有特異性。

6.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中［Ca2+］的測定 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是Ca2+釋放的重要細(xì)胞器，其所含的Ca2+已經(jīng)成功的被所有類型的光學(xué)Ca2+探針(包含天然水母熒光素、人工熒光蛋白以及低分子量的熒光指示劑)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的管腔內(nèi)所捕捉到。Demaurex等［17］通過研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用光學(xué)鈣離子探針能夠很成功的快速定位和固定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+。此法相比之前的探針方法有了很大的改進(jìn)。cameleon蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率不會影響Ca2+的生理濃度。新型cameleon具有適合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+測量的Kd值以及具有合理的動態(tài)范圍。將鈣網(wǎng)硬蛋白信號序列以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留信號(KDEL)添加到cameleon Design 1(D1)中，從而形成以內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+為目標(biāo)的 cameleon(D1ER)。Palmer等［18］指出 D1ER在內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Ca2+測量的敏感度方面提供了相當(dāng)大的改善，要比以往的 cameleon YC4.3ER要優(yōu)越。D1ER與Fura-2的完美結(jié)合，可以用來同步測量各種比例的細(xì)胞溶質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所含的Ca2+。

Hofer等［19］最早使用低分子量鈣指示劑測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所含Ca2+濃度。低分子量鈣指示劑Mag-Fura-2的乙酰甲氧酯在胞液和細(xì)胞內(nèi)間隔中積累，隨后通過洋地黃或人參皂苷對Ca2+作用，使Ca2+經(jīng)由質(zhì)膜選擇性滲透釋放出來，隨后與指示劑作用通過熒光強(qiáng)度得出結(jié)果［20］。Park等［21］使用整體單元形狀貼片夾具方法用來除去細(xì)胞溶質(zhì)的指示劑。此法可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的細(xì)胞腔中對Ca2+濃度的動態(tài)變化進(jìn)行記錄并保存質(zhì)膜的完整性。

20世紀(jì)90年代初，Kendall等［22］最早開始嘗試研究可用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+測量的水母熒光素。由于水母熒光素親合性低，研究者嘗試不同類型的熒光素發(fā)光底物進(jìn)行改進(jìn)。使得該技術(shù)可以用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的測量。Demaurex等［23］通過方法改良以及半合成技術(shù)研究出人工水母發(fā)光蛋白嵌合體，能夠適合于在肌漿網(wǎng)細(xì)胞腔中對Ca2+進(jìn)行測量。

6.3 內(nèi)體(endosome)以及溶酶體中［Ca2+］的測量 Ca2+在內(nèi)體以及溶酶體運(yùn)輸過程中具有重要作用。Ca2+指示劑BAPTA可以快速與細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)的Ca2+進(jìn)行螯合，從而可以抑制初級內(nèi)體的融合作用。Pryor等［24］研究發(fā)現(xiàn)一些Ca2+指示劑還可以抑制次級內(nèi)體與溶酶體酶的運(yùn)輸小泡的融合作用。目前常使用低親合性鈣指示劑Oregon Green 488 BAPTA-5N測量內(nèi)體中Ca2+的濃度，此指示劑在初級內(nèi)體中具有一定程度的耐酸性［25］。研究發(fā)現(xiàn)初級內(nèi)體的Ca2+濃度相對較低，Ca2+損失與細(xì)胞器酸化有密切關(guān)系。Christensen等［26］使用Fura-2右旋糖苷以及 Oregon Green BAPTA-1右旋糖酐指示劑測定Ca2+，發(fā)現(xiàn)來自內(nèi)體的Ca2+的溢出可能參與細(xì)胞器早期的酸化作用。次級內(nèi)體以及溶酶體的Ca2+濃度遠(yuǎn)超過初級內(nèi)體的Ca2+濃度。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)次級內(nèi)體以及溶酶體的相對較高的Ca2+濃度需要細(xì)胞器內(nèi)的蛋白具有一定的酸性pH值。加入擾亂溶酶體的酸性因子可以導(dǎo)致細(xì)胞器蛋白內(nèi)Ca2+的急劇減少。這說明只要細(xì)胞器的酸性化程度充分，H+/Ca2+交換便可能積累相當(dāng)數(shù)量的Ca2+并且可以作為細(xì)胞器的Ca2+信號源［27］。

6.4 細(xì)胞核內(nèi)［Ca2+］的測量 Ca2+離子在細(xì)胞核的生命進(jìn)程中具有重要調(diào)節(jié)作用，包括基因表達(dá)，DNA復(fù)制、蛋白的磷酸化作用，細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用［28］。外部核膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜極其相似，事實(shí)上它是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)薄膜的延長部分。核膜的胞腔與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相連，而內(nèi)部核膜的成分與外部的核膜不同。細(xì)胞核通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型Ca2+-ATP酶積累Ca2+。核膜包含鈣結(jié)合蛋白鈣網(wǎng)硬蛋白以及鈣釋放渠道InsP3Rs、毒蔁堿受體、蘭尼堿受體等［29-30］。細(xì)胞核是一種很大的細(xì)胞器，可以通過熒光Ca2+敏感指示劑和共聚焦顯微技術(shù)與細(xì)胞質(zhì)區(qū)分出來。目前低分子量指示劑廣泛用來測定Ca2+并比較細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中Ca2+的信號差異［31］。

通過細(xì)胞核定位信號，將具有熒光性的Ca2+感應(yīng)蛋白cameleon定位到細(xì)胞核中［32］。改良的 cameleon降低了對pH的敏感度，其鑲嵌于具有特異性的神經(jīng)元表達(dá)序列被成功的引入到下丘腦部分神經(jīng)元中，這一過程顯示Ca2+在細(xì)胞核和胞質(zhì)調(diào)節(jié)方面存在著一定的差異［33］。Nagai等［34］使用pericam指示劑來監(jiān)測Ca2+在人子宮頸癌傳代細(xì)胞的細(xì)胞核中的濃度變化，并且對線粒體初期Ca2+變化進(jìn)行比較。pericam指示劑還用于與細(xì)胞質(zhì)和線粒體指示劑相結(jié)合的心肌細(xì)胞中，該研究顯示了細(xì)胞區(qū)室中的同步Ca2+濃度震蕩過程［35］。

7 總結(jié)

通過對組織和細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的動態(tài)監(jiān)測與準(zhǔn)確測定，能更深入的認(rèn)識許多生理和病理過程，對與Ca2+參與的相關(guān)藥物作用機(jī)制的研究有極其重要意義。Ca2+測定方法不同，同種方法所用的指示劑又不盡相同。但每種測定方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此實(shí)驗(yàn)前應(yīng)根據(jù)個人的實(shí)驗(yàn)?zāi)康淖屑?xì)選擇正確、簡便、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，以及合理和現(xiàn)有的指示劑與信號檢測儀。通過嚴(yán)謹(jǐn)科學(xué)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以最終獲得成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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