阻斷內毒素信號轉導治療內毒素血癥的研究進展

張 馨, 汪茂榮

內毒素(endotoxin)是由革蘭陰性菌所產生、存在于菌體內的一類毒素,是菌體細胞壁的組成成分。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性細菌內毒素的重要成分,是最經典、最初確認的致病因子,是迄今為止研究最深入的病原體相關模式分子(pathogen-associated pattern molecular,PAPM)。內毒素有多種生物活性,進入人體血液可造成內毒素血癥,可引起多種病理生理變化如發(fā)熱、休克、彌散性血管內凝血和粒細胞減少等,可造成嚴重后果如呼吸窘迫綜合征、急性腎衰竭,甚至多器官功能衰竭等多種疾病,最終可因內毒素休克死亡。多年來,關于LPS信號轉導機制研究顯示,LPS在細胞外在LPS結合蛋白(LPS-binding protein,LBP)、CD14、髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD-2)協(xié)助下導致Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,T LR4)受體寡聚化激活,將LPS刺激信號向細胞內轉導,通過髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴和非MyD88依賴的兩條途徑觸發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應,誘導促炎細胞因子的表達,最后啟動炎癥反應。TLR4信號轉導通路在這一過程中起著極其重要的作用,成為治療內毒素血癥研究中的重要靶點。

目前,對內毒素血癥尚缺乏特效藥物,一旦炎癥反應發(fā)生,要打斷級聯(lián)的病理反應過程,就需要采取多位點的藥物治療。復合藥物的療效明顯優(yōu)于單一藥物的治療,臨床上多采用綜合治療。主要治療手段有：①抗感染、減少內毒素的產生和吸收。包括抗生素的使用、LPS合成抑制劑的應用、選擇性腸道清潔療法清潔腸道、改善腸道內環(huán)境。②清除血液中的內毒素。包括血漿凈化技術、殺菌/通透性增加蛋白、抗菌蛋白、抗菌多肽、鱟抗LPS因子等。③阻斷內毒素的信號轉導通路或減輕其產生的炎癥效應。④加強支持治療,增強機體對LPS的抵抗力。包括使用免疫調節(jié)劑和支持治療、抗氧化劑的應用、中藥制劑等。目前研究主要集中于對內毒素受體、受體信號轉導途徑及各途徑間的相互關系上,在此研究基礎上,阻斷內毒素的信號轉導通路可能成為治療內毒素血癥最有效的手段。本文就近年來阻斷內毒素的信號轉導通路治療內毒素血癥相關研究進展綜述如下。

一、內毒素抗體

由于脂質A的基本骨架在不同種屬的細菌間基本一致,因此,利用 LPS的抗原特異性研制抗LPS抗體是抗LPS治療的重要途徑。抗LPS抗體能中和內毒素的實驗研究結果,被認為可給內毒素血癥的治療帶來新的契機。特別是當抗LPS抗體研制和生產技術不斷進步,由多克隆抗體到單克隆抗體產品的轉化,曾經進入臨床試驗的有美國研制的鼠源性IgM單抗 E5和人源性的脂質 A單抗HA-IA。Manthous等[1]曾用 LPS McAbHA-IA治療1例無明確感染灶而出現(xiàn)低血壓休克的暴發(fā)性肝衰竭患者,結果肝功能改善,病情好轉。但抗體存在有菌型抗原的特異性,在后期的臨床試驗中由于其療效未能被證實而自然終止[2]。1993年 Akita等[3]和Warr等[4]報道應用LPS免疫產蛋母雞,可以獲得大量類似于單克隆抗體的雞蛋黃抗體IgY。IgY本質上是一種IgG,是雞血液中的IgG被選擇性的轉移到卵黃中,而且是卵黃中的唯一免疫球蛋白類。IgY對酸、酶、溫度具有較高的穩(wěn)定性,且其被胃蛋白酶消化后所得的Fab′片段穩(wěn)定性和活性更強,為通過口服給藥、中和腸道內LPS提供了可能。目前,國內外抗LPS雞蛋黃IgY抗體的制備和藥理研究仍在進行中。

二、LPS受體拮抗劑

(一)E5531[5-8]阻斷內毒素產生生物學效應的最有效的環(huán)節(jié)應是阻斷內毒素與其受體結合。在過去的16年中,人們熱衷研究合成多種不同的脂質A結構類似物,最終有2代合成類似物進入了臨床試驗階段。第一代脂質A類似物是E5531,一種在紅英膜細菌(Rhodobacter capsulatus)脂質A結構基礎上合成的類似物不但本身無毒性,而且可抑制其他革蘭陰性菌誘導產生細胞因子。體外實驗表明,E5531可抑制內毒素刺激鼠腹腔巨噬細胞,人血單核細胞 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 及 IL-10、一氧化氮(NO)的產生。E5531拮抗內毒素作用的機制在于：E5531能競爭性地與內毒素結合蛋白 LBP結合,進而抑制內毒素與CD14受體及T LR4結合,從而阻斷內毒素的信號轉導所引起的細胞活性。2000年E5531進入I期臨床試驗,證實E5531可改善內毒素引起的頭痛、惡心、發(fā)熱、心動過速、血壓下降等癥狀和體征,降低受試者血中 TNF-α、IL-6、C反應蛋白及白細胞計數(shù)。后E5531進入Ⅱ期臨床試驗階段,用于LPS引起的發(fā)熱和感染性休克的治療。但研究表明,E5531活性呈時間依賴性降低,可能是由于E5531與血漿脂蛋白相互作用的原因,限制了其臨床應用。

(二)E5564[9-14]E5564來源于球形紅螺菌(R phaeroides),被稱為第二代 LPS拮抗劑,其結構、合成較E5531簡單,且比E5531有更高的活性和藥理學特性。雖然E5564也像E5531一樣會與血漿中脂蛋白結合而失去活性,但比E5531在血漿中保持活性的能力強。Mullarkey等[11]研究表明,E5564的作用機制可能是與T LR4/MD-2復合體結合后阻斷內毒素的信號轉導,而與血漿中的LBP和可溶性CD14關系不大。最近,Kim等[10]對TLR4/MD-2與E5564相結合的三維結構進行了描述,更證實了這些分子之間的關系。在體外實驗,E5564與抗生素聯(lián)用可使小鼠死亡率比單用抗生素減少60%。E5564的安全性和耐受性也在I期臨床試驗中得到了證實。除了偶發(fā)的靜脈炎外,E5564的耐受劑量和時間分別達到了252 mg和72 h以上。研究表明,與E5531相比,E5564對CK的產生具有更強的抑制作用,且能維持一段時間的高劑量活性,可能對臨床治療更有利。2005年Eisai(日本衛(wèi)材)公司公布了Eritoran(E5564商品名)用于治療嚴重敗血癥的北美Ⅱ期臨床試驗結果。與安慰劑組相比,特定劑量的Eritoran組總病死率要低6%。Eritoran研究收入的293例患者,隨機分為3組：高劑量組(105 mg/d,療程6 d),低劑量組(45 mg/d,療程6 d)及安慰劑組。衛(wèi)材公司指出,該研究的總目標是與安慰劑組相比,在28 d時的總病死率至少低5%。根據(jù)PROM(APACHE Ⅱ預期病死率風險)評分,高風險亞組死亡獲益最大,其中高劑量組病死率為33.3%,低劑量組為37.9%,安慰劑組為50.9%。與安慰劑相比,高劑量組病死率低 17.6%(P=0.07),低劑量組病死率低13%(P=0.17)。Eritoran的治療膿毒癥Ⅲ期臨床試驗于2006年6月在北美、南美、歐盟等地區(qū)250所單位展開,預期2009年底能獲得總結資料。E5564是目前看來的一種具有良好臨床應用前景的內毒素受體阻斷劑。

(三)CRX-526[15-17]CRX-526是一種化學合成的脂質A類似物,由于其分子中次級脂肪?；溳^短,使其失去了脂質A一樣的致炎作用。在2種小鼠結腸炎的模型中觀察到,無論在體內或體外,CRX-526可阻斷LPS誘導的單核細胞促炎因子的生成、釋放。研究顯示,用大劑量CRX-526在LPS刺激前預處理人單核細胞,可完全抑制LPS誘導的基因轉錄。其確切的作用機制尚在研究中。有一種假設,CRX-526可能是通過直接與TLR4受體復合物相結合,從空間上抑制LPS與之結合。

(四)抗CD14抗體 IC14,一種抗人CD14的嵌合單克隆抗體,研究表明其能明顯減輕LPS的生物效應,能明顯降低LPS引起的發(fā)熱等臨床癥狀和白細胞升高,抑制TNF-α、IL-6和 IL-10的產生[18]。I期臨床試驗結果顯示IC14可減輕LPS誘導的全身炎癥反應,成為阻止嚴重敗血癥器官衰竭的可行治療手段[19]。此外,該試驗結果還顯示,無論是健康志愿者或嚴重敗血癥患者,機體對IC14具有良好的耐受性,不增加繼發(fā)感染的發(fā)生率。與健康人相比,對于嚴重敗血癥患者,需要更高劑量的IC14來使mCD14飽和。近期有研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制補體和封閉CD14可有效減輕 LPS誘導的炎癥反應[20]?？笴D14抗體能使粒細胞表面的CD14分子飽和,以劑量依賴性抑制LPS誘導的促炎細胞因子TNF-α、IL-1β釋放,但對細菌無清除作用。同時抑制補體可有效減輕炎癥反應,但補體的抑制可減少對細菌的清除,故要聯(lián)合抗生素的應用,協(xié)同發(fā)揮作用[21]。

(五)抗T LR4抗體[22-24]T LR4蛋白被認為是內毒素激活炎癥反應的關鍵節(jié)點,控制T LR4受體的過度活化,可有效抑制其引起的過激炎癥反應。封閉TLR4的作用可能很大程度上阻斷LPS向胞內傳導信號,從而阻斷LPS的一系列胞內下游反應。T LR4基因敲除小鼠表現(xiàn)出對LPS的低反應性,LPS不能誘導致死性打擊。體外觀察發(fā)現(xiàn),抗T LR4抗體可抑制 LPS誘導的核因子-κ B(NF-κ B)活化及炎癥介質的產生。目前,已有抗T LR4抗體在細胞、動物模型等試驗水平獲得較滿意的結果。臨床上應用尚有待進一步的研究。

三、LPS信號轉導干擾分子

這一類因子不能稱之為LPS受體拮抗劑,但它們在TLR4細胞內信號轉導無論上游還是下游過程中,均拮抗LPS誘導的生物學效應。LPS信號轉導干擾分子包括人工合成肽和有機分子。

(一)TAK-242--環(huán)己烯衍生物[25-28]2005年,日本Takeda化學實驗室應用LPS刺激小鼠巨噬細胞,從其產物中篩選可以抑制炎癥介質產生的小分子物質,發(fā)現(xiàn)了一種編號5a的前導化合物有此作用,據(jù)此設計合成了一系列含氨磺酰基和酯類基團的環(huán)己烯衍生物。在抑制炎癥介質NO產生的實驗中發(fā)現(xiàn)其中TAK-242活性最強。TAK-242在體內外均能抑制 LPS介導的 NO、TNF-α、IL-6的產生。體內試驗中,在3 mg/kg劑量下,LPS休克小鼠全部成活。TAK-242幾乎完全抑制LPS誘導的小鼠RAW264.7細胞、人U937和P31/FUJ細胞 NO和TNF-α的產生,而具有抗炎作用的IL-8的產生則不受影響。最新的一項研究結果,TAK-242抑制炎癥介質的種類很多,除NO、TNF-α、IL-6外還包括 IL-1β、IL-6、巨噬細胞抑制蛋白-2、前列腺素等,小鼠在注射LPS前1 h靜脈注射TAK-242,血清內上述炎癥介質水平降低,LPS休克小鼠的保護率升高,均呈劑量梯度效應,當劑量達到1 mg/kg時,保護率達100%。研究顯示,即使在 LPS處理2 h后注射TAK-242,也能改善肝、腎功能障礙,降低 LPS的致死率,即使在器官已出現(xiàn)功能障礙之后。這一現(xiàn)象的機制尚不明確,有可能是由于其分子量小,能快速分布在組織中并緩解炎癥。由于TAK-242能夠有效抑制LPS介導的多種細胞因子及炎癥介質的產生,并且在 LPS攻擊后給藥仍能迅速起效,因而自2005年首次報道以后,很快進入臨床試驗階段,Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗在日本、美國、歐洲國家進行,然后又迅速在全球范圍內展開Ⅲ期臨床試驗。但由于臨床試驗中藥物在人體的有效性和安全性的不確定以及藥物開發(fā)的時間、經濟成本等問題,日本武田制藥公司于2009年2月宣布停止TAK-242的研究。

(二)髓樣細胞觸發(fā)性受體肽[29-30]髓樣細胞觸發(fā)性受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cell-1,TREM-1)是2000年新發(fā)現(xiàn)的表達于單核/巨噬細胞等髓樣細胞表面的激活型受體,能在細菌或LPS等的刺激下觸發(fā)髓樣細胞產生大量炎性因子,從而在炎癥反應的觸發(fā)和放大過程中起重要作用。多形核白細胞和單核/巨噬細胞的T REM-1表達可被LPS誘導。在 TREM-1序列基礎上,Gibot等[30]合成了LP17。培養(yǎng)液中添加LP17或IL-10后,LPS刺激后的促炎細胞因子的生成明顯減少。LP17劑量依賴性地抑制LPS誘導的TNF-α和IL-1β生成,可抑制 TREM-1導致的NF-κ B活化。此外,在給予大鼠致死劑量 LPS前1 h予LP17預處理,將呈劑量依賴性阻止大鼠死亡,且對給予LD100 LPS的大鼠4 h后延遲治療仍具有顯著的保護作用,在其后的 1周內未發(fā)生延遲死亡,提示LP17不僅僅延遲始動階段LPS的致死性,還發(fā)揮持續(xù)性的保護作用。

(三)貝西沙星(besifloxacin)[31-32]貝西沙星是一種新型氟喹諾酮類抗菌藥物,用于眼部感染的局部治療。最近研究結果提示,貝西沙星顯著抑制LPS誘導的 THP-1單核細胞細胞因子生成,這些細胞因子可分為 2組,一組包括GM-CSF、IL-1β、IL-8、IP-10、MCP-1 、MCP-1α,對于這一組細胞因子,莫西沙星和貝西沙星具有相當?shù)囊种谱饔?另一組包括G-CSF 、IL-1α、IL-1ra、IL-6 、血管內皮生長因子(VEGF),貝西沙星較莫西沙星抑制作用強,而后者在抑制IL-12p40的生成較前者強。這一抑制作用的潛在機制尚不明確,有報道莫西沙星抑制單核細胞和囊性纖維化上皮細胞的MAP激酶和NF-κ B的活化。

(四)復合物K[33-34]近來,Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)復合物K,一種人和大鼠腸道細菌對原人參二醇人參皂苷 Rb1、Rb2和 Rc的代謝產物,能調節(jié)T LR4介導的炎癥應答。MyD88依賴途徑的TLR2和T LR4介導的炎癥應答均能被復合物K減弱,它作為糖皮質激素受體的激動劑配體發(fā)揮其相關功能。

四、其他內毒素拮抗劑

(一)多黏菌素B(polymyxin B,PMB)[35-36]PMB是從多黏桿菌分離得來的一種陽離子環(huán)十肽,N端連有一個8碳或9碳的飽和脂肪酸。PMB可直接與攜帶陰離子的脂質A部分特異性結合,從而抑制脂質A的生物學活性,導致革蘭陰性菌外膜通透性增加,因此,PMB兼有中和LPS和抗菌的雙重作用。PMB是目前已知的LPS中和能力最強的多肽,往往作為LPS中和試驗的金標準。但由于其具有明顯的神經毒性和腎毒性,臨床使用一直受到限制。人們對PMB的結構進行了改造,在酶的作用下脫去氮端酰基變成不含脂肪酸側鏈的九肽,這種改造消除了PMB的毒性,但也失去了殺菌活性,不過仍然保留了與LPS和LipidA特異性結合并中和LPS的生物學活性。

(二)Bac7(1-35)[37-38]Bac7(1-35)是一種人工合成的富含絲胺酸的多肽,來源于牛中性粒細胞中一種具有抗菌作用的蛋白質片段。在體外中和LPS能力與PMB相當,在10 mmol/L濃度下即能完全抑制內毒素的活性,腹腔注射Bac7(1-35)1 mg/kg能顯著降低內毒素膿毒癥大鼠的死亡率,與60 mg/kg劑量的PMB作用相當,顯示出良好的抗LPS活性。

盡管目前的診斷技術、外科治療手段及新抗生素的研發(fā)都有很大進展,嚴重的革蘭陰性細菌感染所致敗血癥仍會導致很高的病死率(約30%～50%)。分子和細胞生物學技術的發(fā)展使內毒素信號轉導通路的相關研究取得很大的進展,包括通路中關鍵分子的結構、作用機制,以及人工合成分子阻斷內毒素的信號轉導可能成為治療內毒素血癥的有效手段。

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