T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

蘇俊華, 朱莉莉, 陳建華, 保 凌, 趙 勤, 梁桂亮, 楊慧仙, 施巧霞, 段志妹

近年來(lái),結(jié)核病的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。目前全球每年新增病例約800萬(wàn)例[1],我國(guó)是世界上僅次于印度的第2個(gè)結(jié)核病大國(guó),結(jié)核感染率為44.5%,活動(dòng)性結(jié)核患者450萬(wàn),每年死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)[2]。世界衛(wèi)生組織2004年的報(bào)告顯示,結(jié)核病診斷率僅為37%,即使在發(fā)達(dá)國(guó)家也僅有50%的結(jié)核病例通過(guò)細(xì)菌學(xué)方法被證實(shí)[3]。我院常用的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法是痰、肺泡灌洗液和支氣管毛刷檢物涂片、鏡檢法和培養(yǎng)法,以及分子生物學(xué)技術(shù)(TB-DNA)檢測(cè)、結(jié)核抗體和精制結(jié)核菌素試驗(yàn)(PPD)等檢測(cè)項(xiàng)目,其中痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性率2007—2008年僅為23%左右,而傳統(tǒng)的結(jié)核分枝桿菌羅氏培養(yǎng)因靈敏度低,檢測(cè)周期長(zhǎng)等原因,臨床未作為常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目,因此尋找一種準(zhǔn)確快速可靠的診斷結(jié)核的方法十分迫切。

最近幾年,一些國(guó)家和地區(qū)以及我國(guó)的上海等地已經(jīng)將酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(ELISPOT)用于結(jié)核病的診斷,相關(guān)報(bào)道日益增多。結(jié)核分枝桿菌感染T淋巴細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-Spot.TB)是由ELISPOT發(fā)展而來(lái),為考察此技術(shù)在我院的應(yīng)用情況,特進(jìn)行下列試驗(yàn),現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

材料與方法

一、研究對(duì)象

確診結(jié)核組[以痰涂片抗酸桿菌和(或)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性為標(biāo)準(zhǔn)]30例,其中23例肺結(jié)核,7例肺外結(jié)核,年齡1～65歲。男 21例,女 9例。其中結(jié)核住院患者23例,HIV合并結(jié)核感染7例。懷疑結(jié)核組53例,該組患者臨床及影像學(xué)疑似結(jié)核,但痰涂片抗酸桿菌及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)均為陰性。53例中44例疑似肺結(jié)核,9例疑似肺外結(jié)核。年齡19～80歲,男35例,女 18例。其中 24例為HIV感染者。正常對(duì)照組32名,其中健康體檢者28名,余4例為排除結(jié)核感染的呼吸道感染住院患者。年齡22～61歲,男8名,女24名。

二、儀器和試劑

Baker生物安全柜,RIVCO CO2孵育箱。TSpot.TB試劑盒(英國(guó)牛津Immunotec生產(chǎn)),淋巴細(xì)胞分離液、AIMV、RPMI1640由上海長(zhǎng)征復(fù)星公司提供。

三、原理和方法

(一)原理 T-Spot.TB技術(shù)是利用結(jié)核分枝桿菌感染外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中存在結(jié)核特異性T細(xì)胞,這些T淋巴細(xì)胞在受到結(jié)核分枝桿菌特異抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和結(jié)核特異的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原B(CFP-10)與對(duì)照試劑一起加入預(yù)包被干擾素抗體的微孔板進(jìn)行培養(yǎng)孵育。當(dāng)PBMC中存在特異性T細(xì)胞時(shí),培養(yǎng)液中加入的結(jié)核分枝桿菌特異混合抗原多肽A和多肽B將刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕獲,再次加入的堿性磷酸酶標(biāo)記抗體與被捕獲的IFN-γ相結(jié)合,滯留在微孔板上,加入顯色底物溶液在反應(yīng)部位形成不溶性色素沉著斑點(diǎn)。每1個(gè)斑點(diǎn)代表1個(gè)結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞,根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)可以判斷體內(nèi)是否存在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞,并可計(jì)數(shù)T細(xì)胞的數(shù)量。

(二)方法 ①采集4 mL外周血標(biāo)本置于肝素鋰抗凝的試管中,立即混勻,在4 h內(nèi)進(jìn)行PBMC分離。②離心管中預(yù)先加入4 mL RPMI 1640液,將混勻的4 mL抗凝全血加入離心管中,混勻。③另一離心管中預(yù)先加入3 mL淋巴細(xì)胞分離液,將混勻的8 mL細(xì)胞懸液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上方,1 600 g離心22 min,用加樣槍吸取白細(xì)胞層到15 mL離心管中。④再加入RPMI 1640至11 mL,600 g離心7 min,棄去上清液。⑤加入AIMV培養(yǎng)液至11 mL,350 g離心7 min,棄去上清液。⑥加入0.7 mL AIMV液,充分搖勻使細(xì)胞懸液混勻。吸取10 μ L細(xì)胞懸液于40 μ L錐蟲(chóng)蘭染液中混勻,再吸取10 μ L加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。

每份標(biāo)本調(diào)整至每毫升250萬(wàn)個(gè)PBMC。取出T-Spot.TB試劑盒內(nèi)微孔板,根據(jù)標(biāo)本量取出板條。1份標(biāo)本需4個(gè)微孔板,陰性對(duì)照加AIMV,陽(yáng)性對(duì)照加植物血凝素(試劑盒內(nèi)提供),另外2個(gè)孔分別加入抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)各50 μ L,然后每孔分別加入 100 μ L細(xì)胞懸液(即含有250 000個(gè)PBMC的懸液)。將微孔板放入5%CO2孵箱中孵育16～20 h,用 pH6.8～7.2的 PBS液洗板。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50 μ L,2～8℃冰箱孵育1 h,再用PBS液洗板,最后每孔加入顯色液50 μ L。避光室溫靜置7 min,用蒸餾水沖洗后觀察結(jié)果。用放大鏡觀察記錄每個(gè)孔中的斑點(diǎn)。

(三)結(jié)果判定 依據(jù)試劑盒內(nèi)所附判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行,陰性斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè),抗原A和抗原B檢測(cè)孔計(jì)數(shù)-陰性孔計(jì)數(shù)≥6判為陽(yáng)性。如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6,檢測(cè)孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍陰性孔斑點(diǎn)數(shù)判為陽(yáng)性。

結(jié) 果

確診結(jié)核組：即痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性或其他體液標(biāo)本涂片陽(yáng)性和(或)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性的病例。30個(gè)標(biāo)本中,檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性25例,檢測(cè)靈敏度為83.3%(25/30)。正常對(duì)照組：共檢測(cè)32例,檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性6例,陰性26例,特異度為81.3%(26/32)。疑似結(jié)核組：該組患者臨床及影像學(xué)疑似結(jié)核,但涂片及培養(yǎng)均為陰性。本組病例53例,檢測(cè)陽(yáng)性28例,陽(yáng)性率為52.8%(28/53)。T-Spot.TB試驗(yàn)結(jié)果分布見(jiàn)表1。

表1 T-Spot.TB實(shí)驗(yàn)結(jié)果和治療效果的比較Table 1.Comparison between results of T-Spot TB and clinical outcome

對(duì)肺外結(jié)核的檢測(cè)結(jié)果：共有16例,入組的肺外結(jié)核包括結(jié)核性腦膜炎4例、結(jié)核性胸膜炎2例、腎結(jié)核1例、結(jié)核性腹膜炎4例、關(guān)節(jié)結(jié)核1例和淋巴結(jié)核4例,T-Spot.TB陽(yáng)性13例,陽(yáng)性率達(dá)81.2%。

討 論

在確診結(jié)核組中T-Spot.TB結(jié)果陰性者5例,有2例是在抗結(jié)核療程超過(guò)1個(gè)月后進(jìn)行檢測(cè)。有報(bào)道指出效應(yīng)T淋巴細(xì)胞存活期很短,一般在病原體消滅后就消失[4]。所以我們推測(cè)這2例患者可能是治療后患者特異的T細(xì)胞計(jì)數(shù)迅速降低,故 TSpot.TB檢測(cè)陰性。另有報(bào)道嚴(yán)重的肺結(jié)核抑制了外周血T淋巴細(xì)胞的反應(yīng),可能導(dǎo)致這些患者缺乏可以檢測(cè)到分泌IFN-γ的特異T細(xì)胞。

正常對(duì)照組中T-Spot.TB結(jié)果陽(yáng)性的6例標(biāo)本,其中4例的標(biāo)本來(lái)自健康體檢者,均為我科工作人員,年齡25～35歲,平時(shí)工作中與結(jié)核患者及其標(biāo)本均有接觸,接觸時(shí)間平均4年,屬高危人群。由于目前國(guó)際尚無(wú)結(jié)核隱性感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn),無(wú)法進(jìn)行驗(yàn)證和排除,這4名體檢者可能為隱性感染者,另2例均為腫瘤患者,他們是否也存在潛伏感染尚不能證實(shí)。

從表1中我們可以看出疑似結(jié)核組：①抗結(jié)核治療有效28例,其中19例T-Spot.TB結(jié)果陽(yáng)性,與最后臨床診斷符合率是67.9%(19/28),即陽(yáng)性預(yù)測(cè)值;9例T-Spot.TB結(jié)果為陰性,經(jīng)抗結(jié)核治療有效。值得注意的是9例中7例為HIV感染合并結(jié)核,他們?cè)谠撛囼?yàn)中的低反應(yīng)性可能是由于HIV相關(guān)的CD4細(xì)胞減少所致,由于檢測(cè)病例太少,我們未做相關(guān)CD4計(jì)數(shù)的對(duì)比。贊比亞的一項(xiàng)研究表明,RD1基因產(chǎn)物ELTSpot實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性反應(yīng)率在HIV感染者是降低的[5]。②19例進(jìn)行抗感染對(duì)癥治療等措施,16例治愈好轉(zhuǎn),其中12例 TSpot TB陰性,4例陽(yáng)性,試驗(yàn)陰性與臨床診斷排除結(jié)核者的符合率為75.0%(12/16),即陰性預(yù)測(cè)值;假陽(yáng)性率為25.0%(4/16)。假陽(yáng)性的4例中有1例是陳舊性結(jié)核,現(xiàn)在是以十二指腸炎住院,對(duì)癥治療后出院,該例患者不能排除其體內(nèi)還存在結(jié)核分枝桿菌,另外4例中有3例PPD陽(yáng)性,他們有可能為潛伏感染者。

在實(shí)際觀察中,T-Spot.TB檢測(cè)的靈敏度83.3%,特異度為81.3%。這2個(gè)數(shù)據(jù)均低于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)報(bào)道[3-6]。分析其靈敏度較低可能因?yàn)門(mén)Spot.TB是基于免疫反應(yīng),納入確診結(jié)核組中有部分HIV感染患者,其免疫力低下所致;特異度觀察中,我們納入了與結(jié)核病有密切接觸者,可能存在潛伏感染而降低了特異度?，F(xiàn)在我國(guó)的現(xiàn)狀結(jié)核病的診斷率不足60%[3],PPD的靈敏度約為60%,但免疫低下患者陽(yáng)性率僅為20%～30%,雖然該試驗(yàn)操作方便、觀察結(jié)果容易,但靈敏度和特異度均不理想,曾經(jīng)有結(jié)核感染和接種卡介苗都可能出現(xiàn)假陽(yáng)性,臨床診斷的意義不大;結(jié)核抗體檢查同樣存在特異性不高的情況,所以臨床懷疑結(jié)核而又無(wú)病原學(xué)資料時(shí),T-Spot.TB試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床有指導(dǎo)價(jià)值,T-Spot.TB陽(yáng)性者67.9%可能是結(jié)核(陽(yáng)性預(yù)測(cè)值)。若T-Spot.TB試驗(yàn)陰性,75.0%的概率可以排除結(jié)核感染(陰性預(yù)測(cè)值)。

綜合以上分析和國(guó)內(nèi)外的一些研究,T-Spot.TB技術(shù)作為一種新的檢測(cè)結(jié)核感染的免疫學(xué)方法,它提高了結(jié)核檢測(cè)陽(yáng)性率,可作為結(jié)核病早期診斷的一項(xiàng)輔助檢查手段,可用于臨床癥狀不典型、PPD診斷不明確和痰涂片培養(yǎng)均為陰性的疑似結(jié)核患者,此檢查方法具有較高的靈敏度和特異度,對(duì)肺外結(jié)核的診斷也很有價(jià)值。T-Spot.TB試驗(yàn)采用外周血檢測(cè),簡(jiǎn)便易行,并且能快速出結(jié)果(第2天)。T-Spot.TB的應(yīng)用不僅可使患者得到早期診斷,及時(shí)治療避免誤診,減少抗藥性,節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用;測(cè)定效應(yīng)T淋巴細(xì)胞也可以反應(yīng)機(jī)體是否清除了病原體,作為判斷治療是否有效的一項(xiàng)指標(biāo)[4]。但T-Spot.TB檢測(cè)試劑盒價(jià)格昂貴,對(duì)低收入患者及地區(qū)有一定困難。

[1] Global tuberculosis control：surverllance,planning,financing.WHO report2005.GeneraWorld Health Organization(WHO/HTM/TB/2005.349).

[2] 全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2000年全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J].中國(guó)防癆雜志,2002,24(2)：65-108.

[3] 樂(lè)軍,梁莉,李蘇輝,等.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)快速診斷結(jié)核分枝桿菌感染的臨床應(yīng)用價(jià)值[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2006,29(11)：1005-1008.

[4] 史可云,胡忠義.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2006,29(6)：414-416.

[5] Chapman A L,Munkanta M,Wilkinson KA,et al.Rapid detection of active and latent tuberculousis infection in HIVPositive indicicluals by enumeration of Mycobaterium tuberculosis-specific T cells[J].AIDS,2002,16(17)：2285-2293.

[6] Meier T,Eulenbruch HP,Wrighton-Smith P,et al.Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay(T Spot-TB)for diagnosis of tuberculosis in clinical practice[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2005,24(8)：529-536.