氣管和肺干細(xì)胞定位及其分子調(diào)控機(jī)制

金鑫 石穆穆 李欣 賈心善

1 氣管干細(xì)胞的概念及特性

干細(xì)胞均有3個(gè)特性：干細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)期具有分裂和自我更新的能力；干細(xì)胞沒(méi)有特化功能，即無(wú)法特化任何組織特異性結(jié)構(gòu)而能夠行使特定功能；能夠產(chǎn)生特化細(xì)胞，這個(gè)過(guò)程被稱為分化。此外干細(xì)胞在組織中為數(shù)甚少，而且絕大多數(shù)在靜態(tài)G0期。有關(guān)氣管干細(xì)胞有兩種觀點(diǎn)：

1.1 基底細(xì)胞干細(xì)胞論 基底細(xì)胞表達(dá)P63及角蛋白5和14（Keratin5/14, Krt5/14）[1-5]。成熟氣管組織中的細(xì)胞更新率通常很低[6]，但除纖毛細(xì)胞外，氣管上皮損傷能夠引起其他細(xì)胞迅速增殖[7]，組織修復(fù)的速度很快。Hong等[8]應(yīng)用譜系追蹤法對(duì)經(jīng)萘損傷表達(dá)Krt14-CreER細(xì)胞的研究表明，某些基底細(xì)胞能夠進(jìn)行自我更新，并能生成纖毛細(xì)胞和分泌細(xì)胞。其次，二氧化硫（SO2）吸入法損傷氣管上皮后，部分基底細(xì)胞長(zhǎng)期保持脫氧尿嘧啶（BrdU）標(biāo)記[9]。再次，高度表達(dá)Krt5-綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）的基底細(xì)胞具備更大的增殖及體外克隆的能力[3]。另外，移植受體中，分離的小鼠氣管基底細(xì)胞可以使受損裸露的氣管上皮細(xì)胞恢復(fù)完整[10]。因此認(rèn)為，基底細(xì)胞就是干細(xì)胞。

1.2 基底細(xì)胞祖細(xì)胞論 但是也有證據(jù)不支持基底細(xì)胞就是干細(xì)胞的觀點(diǎn)。Evansi等[10]認(rèn)為，終末細(xì)支氣管沒(méi)有基底細(xì)胞，而可由Clara細(xì)胞修復(fù)；胎兒期發(fā)生過(guò)程中，氣管上皮中基底細(xì)胞發(fā)生于纖毛和粘液細(xì)胞之后，氣管柱狀上皮初期形成時(shí)基底細(xì)胞不是必需的；基底細(xì)胞與柱狀細(xì)胞的同增減數(shù)量比例不恒定；柱狀上皮損傷后，主要反應(yīng)為粘液細(xì)胞而不是基底細(xì)胞。此外Avri Delplanqur[11]發(fā)現(xiàn)，水道蛋白3（AQP3）可表達(dá)于基底細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀，把AQP3（+）的基底細(xì)胞與AQP3（-）的纖毛細(xì)胞及粘液細(xì)胞分離，此后再分別移植，結(jié)果AQP3（+）及AQP3（-）細(xì)胞群均能再建假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮。由此證明基底細(xì)胞與粘液細(xì)胞都能進(jìn)行克隆分化，因而基底細(xì)胞不具備特異性。Daniely等[2]在實(shí)驗(yàn)中敲除了基底細(xì)胞標(biāo)記物P63，在P63陰性的胚胎氣管中，基底細(xì)胞消失，但纖毛細(xì)胞為主的細(xì)胞依然存在，由此證明纖毛細(xì)胞為主的柱狀上皮細(xì)胞不必須由基底細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來(lái)?；准?xì)胞約占?xì)夤芗購(gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮的30%，與干細(xì)胞所應(yīng)占據(jù)的比例不符；基底細(xì)胞表達(dá)角蛋白K14、K5，說(shuō)明其進(jìn)行了一定程度的分化；宋楠等[12]證明穩(wěn)態(tài)下基底細(xì)胞不表達(dá)提示未分化的Oct3/4.Sox2.Nanog基因，提示其已有分化；由于非基底細(xì)胞群能夠再建假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，因此認(rèn)為基底細(xì)胞為祖細(xì)胞，而不是干細(xì)胞。同理，纖毛細(xì)胞出現(xiàn)纖毛，為終末分化細(xì)胞，而粘液細(xì)胞分泌粘液，Clara細(xì)胞分泌特殊顆粒，II型肺泡上皮細(xì)胞含有板層小體，上述細(xì)胞都有所分化且具備特異功能，且數(shù)量很多，因此認(rèn)為它們均為祖細(xì)胞，而不是干細(xì)胞。那么，氣管干細(xì)胞存在于哪里？如何證明其存在呢？

2 氣管干細(xì)胞的證明方法

2.1 慢性標(biāo)記細(xì)胞（LRC）理論被質(zhì)疑 Borthwick[9]通過(guò)連續(xù)在雄鼠氣管內(nèi)滴注聚多卡醇（polidocanol）或SO2吸入法使氣管上皮受損，同期隔日腹膜內(nèi)注射BrdU，95天后在小鼠氣管腺導(dǎo)管內(nèi)發(fā)現(xiàn)了慢性標(biāo)記細(xì)胞。排除3天、95天的標(biāo)記指數(shù)（LI）分別為65%、30%。其中，60%慢性標(biāo)記細(xì)胞集中在上段氣管腺導(dǎo)管；其余集中在下段氣管軟骨-軟骨粘膜接合處；多數(shù)為基底細(xì)胞而少數(shù)為纖毛細(xì)胞，由此提出慢性標(biāo)記細(xì)胞就是干細(xì)胞。

盡管上述觀點(diǎn)曾被許多雜志引用，但由于不能確定小鼠氣管上皮細(xì)胞的壽命，故觀察95天后的細(xì)胞終究為經(jīng)過(guò)幾次分裂后的子細(xì)胞尚屬未知。再者，干細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比例不足10%，那么其中30%的慢性標(biāo)記細(xì)胞中必定混有短暫增殖祖細(xì)胞。

2007年，Kiel等[13]在Nature雜志發(fā)表論文，否定了通過(guò)慢性標(biāo)記細(xì)胞判定干細(xì)胞的可靠性，經(jīng)特征標(biāo)記高度提純?cè)煅杉?xì)胞對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。實(shí)驗(yàn)利用環(huán)磷酰胺以及粒細(xì)胞集落刺激因子處理新生小鼠，給予正常成熟小鼠BrdU 4天-10天后，停用70天。僅少于6%的造血干細(xì)胞保留BrdU，而保留BrdU的骨髓細(xì)胞中，造血干細(xì)胞不足0.5%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BrdU作為造血干細(xì)胞的標(biāo)記，其特異性和敏感性均很低，能否將其用于氣管干細(xì)胞尚須進(jìn)一步證明。

2.2 在G0期細(xì)胞中尋找干細(xì)胞 99%的干細(xì)胞處于G0期，為什么不在G0期中找尋？5-氟尿嘧啶（5-FU）為抗嘧啶類代謝藥，屬于代謝周期性特異的藥物，可使增殖期的氣管粘膜細(xì)胞變性、壞死、脫落，而對(duì)G0期細(xì)胞并不敏感。2003年，賈心善研究組[14]使用5-FU誘發(fā)制成離體大鼠氣管環(huán)嚴(yán)重?fù)p傷的模型，經(jīng)5-FU作用12 h后的氣管環(huán)上皮幾乎全部脫落，殘留間隔分布的裸核樣細(xì)胞呈釘狀，位于基底膜上，PCNA染色細(xì)胞核均為陰性，證明該細(xì)胞為G0期細(xì)胞；去除5-FU 3 h-6 h后，上述細(xì)胞變?yōu)楸馄郊?xì)胞；9 h-12 h后，扁平細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎缴掀ぃ?4 h后，可見(jiàn)到纖毛樣結(jié)構(gòu)、粘液分泌[15]；48 h后氣管被假?gòu)?fù)層柱狀上皮細(xì)胞所覆蓋。在5-FU的打擊下，進(jìn)入細(xì)胞周期的氣管粘膜細(xì)胞變性、壞死、脫落，初始的基底膜是完整的（經(jīng)嗜銀染色證明），那么在上皮修復(fù)過(guò)程中，上皮細(xì)胞只能來(lái)源于殘留的抗5-FU的G0期細(xì)胞。換句話說(shuō)，干細(xì)胞就在其中。筆者認(rèn)為，G0期細(xì)胞分為兩種。其中已分化細(xì)胞將永遠(yuǎn)退出細(xì)胞周期而死亡，而其他再次進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞則為干細(xì)胞，后者隨后轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄郊?xì)胞、立方細(xì)胞，并分化出基底細(xì)胞、粘液細(xì)胞、纖毛細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15-17]提示，氣管干細(xì)胞存在于氣管抗5-FU G0期細(xì)胞中。此后又證明上述細(xì)胞Hoechst33342熒光染色陰性，ABCG2陽(yáng)性。在5-Fu誘發(fā)人支氣管損傷修復(fù)的過(guò)程中，周瑩等[18]證明氣管干細(xì)胞存在于對(duì)5-Fu有抗性的氣管G0期細(xì)胞中。同時(shí)，采用流式細(xì)胞儀方法可富集羅丹明（與Hoechst33342相似）陰性細(xì)胞。王琳琳等[19]觀察了大鼠氣管損傷修復(fù)過(guò)程中ABCG2的動(dòng)態(tài)表達(dá)，證明在正常氣管上皮中ABCG2為陰性。經(jīng)5-Fu打擊后，ABCG2出現(xiàn)，且在培養(yǎng)6 h-12 h達(dá)到高峰，此后隨著干細(xì)胞的分化而下降。廖愛(ài)軍等[20]經(jīng)大鼠體內(nèi)氣管損傷修復(fù)過(guò)程中，氣管干細(xì)胞定位所得的結(jié)果與之相同。

3 細(xì)支氣管及肺干細(xì)胞的幾種觀點(diǎn)

遠(yuǎn)端支氣管不存在基底細(xì)胞，Clara細(xì)胞來(lái)源于經(jīng)萘損傷后少量存活的耐受或“變異”Clara細(xì)胞（Clarav）的增殖與自我更新。在支氣管/細(xì)支氣管交界處存在著緊鄰神經(jīng)上皮小體（NEBs）[21]且保留標(biāo)記的Clara細(xì)胞亞群。后者與細(xì)支氣管/肺交界處均可表達(dá)sftpc和scgb1a1[22]，能夠在萘損傷后進(jìn)行增殖修復(fù)。由于變異Clara細(xì)胞不表達(dá)Cyp2f2酶（一種可將萘轉(zhuǎn)化為毒性產(chǎn)物的P450細(xì)胞色素族），故可耐受萘損傷。這種表達(dá)缺陷反映出其相對(duì)于多數(shù)Clara細(xì)胞而言，為分化較低的細(xì)胞。變異Clara細(xì)胞與更加“經(jīng)典”的未分化干細(xì)胞相比較，僅僅是其所表達(dá)的分化細(xì)胞標(biāo)記物不同［降鈣素基因相關(guān)肽、Clarav細(xì)胞分泌的scgb1a1，以及細(xì)支氣管肺泡干細(xì)胞（BASCs）分泌的sftpc和scgb1a1］。

Giangreco等[23]利用萘處理小鼠終末細(xì)支氣管6 h剝離Clara細(xì)胞后，經(jīng)皮下微泵給予［3H］7天。實(shí)驗(yàn)者將細(xì)胞核內(nèi)含5個(gè)以上銀粒的細(xì)胞定義為“被標(biāo)記”細(xì)胞，含15個(gè)以上銀粒的細(xì)胞定義為L(zhǎng)RCs。45天后，LRCs占全部標(biāo)記細(xì)胞的12%。該實(shí)驗(yàn)將終末細(xì)支氣管干細(xì)胞定位于支氣管腺泡導(dǎo)管連接處（BADJ）[22]。以往的研究中，BASCs的分離及分型多遵照其Sca-1+CD45-CD31-CD34+的免疫表型[24]。而近期的研究將流式細(xì)胞分析與小鼠模型相結(jié)合，Hayashi等[25]認(rèn)為上述標(biāo)記物并不能真正從Clara細(xì)胞群中分離出干細(xì)胞。新的細(xì)胞表型的標(biāo)記物需要通過(guò)細(xì)胞顯微切割和微陣列分析等多項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行證實(shí)。經(jīng)萘損傷后的纖毛細(xì)胞能否跨組織類型分化、變異Clara細(xì)胞與BASCs是否為穩(wěn)態(tài)或受損組織中唯一具備干細(xì)胞潛能的細(xì)胞類型，尚無(wú)定論。有些模型能以其各自方式摧毀纖毛細(xì)胞或I型肺泡細(xì)胞。摧毀方式包括吸入二氧化氮和臭氧（選擇性殺傷纖毛細(xì)胞）等氧化劑或服用博萊霉素（殺滅I型細(xì)胞）等化療劑。上述研究結(jié)果皆支持纖毛細(xì)胞可由Clara細(xì)胞再生而來(lái)，而I型細(xì)胞可由II型細(xì)胞所產(chǎn)生。但這些研究結(jié)果還需要通過(guò)體內(nèi)譜系學(xué)加以證實(shí)[26-28]。而是否所有的II型細(xì)胞都能生成I型細(xì)胞，或是僅在如BASCs等特定區(qū)域才有此能力，目前尚無(wú)定論。

4 氣管及肺干細(xì)胞的分子調(diào)節(jié)

這些研究主要集中在基因操控信號(hào)通路、肺發(fā)育和肺癌發(fā)生過(guò)程所涉及的分子機(jī)制。通過(guò)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，包括β-catenin[29-31]或者通過(guò)MAP激酶或Ras通路，PTEN[32]、GATA-6[33]和Bmi1[34]的信號(hào)途徑。這些研究通過(guò)基因敲除或使用目的基因干預(yù)方法導(dǎo)致靶基因的表達(dá)發(fā)生改變。通過(guò)對(duì)β-Catenin信號(hào)通路的激活，K-Ras[35]信號(hào)途徑或GATA-6[36]、PTEN、PI3激酶或者是p38αMAP激酶[37]的丟失，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致CCSP/Pro-SPC雙免疫陽(yáng)性細(xì)胞的增加和富集，有些學(xué)者認(rèn)為這些就是支氣管干細(xì)胞。將胚胎干細(xì)胞特異基因Oct3/4.Sox2.Nanog導(dǎo)入纖維母細(xì)胞或皮膚細(xì)胞后產(chǎn)生干細(xì)胞樣細(xì)胞，表明其具有維持未分化狀態(tài)的能力[38-43]。Song等[12]最新研究發(fā)現(xiàn)，常態(tài)氣管粘膜上皮不表達(dá)Oct3/4.Nanog.Sox2，而經(jīng)5-Fu處理后，氣管粘膜上皮基底膜僅殘留G0期細(xì)胞，卻出現(xiàn)Oct3/4.Nanog.Sox2表達(dá)。認(rèn)為這些陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞是通過(guò)核再編程，從而轉(zhuǎn)變?yōu)楦杉?xì)胞。細(xì)胞空白區(qū)域填補(bǔ)后，伴隨分化，這些陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞逐漸減少；恢復(fù)假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮后，上皮細(xì)胞恢復(fù)Oct3/4.Nanog.Sox2陰性。初步研究結(jié)果表明，在受到嚴(yán)重打擊后，殘存的G0期細(xì)胞Oct3/4.Nanog.Sox2基因啟動(dòng)子發(fā)生DNA去甲基化，核再編程，表達(dá)Oct3/4.Nanog.Sox2基因，而其本身轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞，隨后Oct3/4.Nanog.Sox2啟動(dòng)子甲基化，基因沉默，干細(xì)胞開(kāi)始分化，亦即表觀遺傳學(xué)調(diào)控干細(xì)胞分化。