PHD finger protein 8蛋白多克隆抗體的制備、純化與檢測(cè)

蔡榮，葉昕

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

PHD finger protein 8蛋白多克隆抗體的制備、純化與檢測(cè)

蔡榮，葉昕

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100101

PHD finger8 (PHF8) 蛋白是最新發(fā)現(xiàn)的一種帶有PHD結(jié)構(gòu)域和Jmjc結(jié)構(gòu)域的蛋白?，F(xiàn)有研究表明其可能在基因轉(zhuǎn)錄、組蛋白去甲基化等方面發(fā)揮重要作用。為研究其功能，本研究構(gòu)建原核表達(dá)載體pET41b-PHF8 (aa886-936)，在大腸桿菌Escherichia coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)帶有GST標(biāo)簽的PHF8 (aa886-936) 親水片段融合蛋白，并純化該片段作為抗原免疫家兔，再以CNBr活化Sepharose 4B微珠純化抗血清制備PHF8特異性多克隆抗體。Western blotting以及免疫熒光檢測(cè)表明該抗體具有很好的特異性，同時(shí)免疫熒光染色的結(jié)果也表明PHF8蛋白定位于細(xì)胞核。

PHF8，多克隆抗體，親和純化

1 材料與方法

1.1 材料

E. coli Top10、BL21菌株和HeLa細(xì)胞株由實(shí)驗(yàn)室 保 存 ； pCMV-SPORT6-PHF8 質(zhì) 粒 購(gòu) 于Openbiosystem。CNBr活化 Sepharose 4B微珠和Glutathione Sepharose 4B微珠購(gòu)于GE Health公司；限制性?xún)?nèi)切酶、Pyrobest酶、dNTPs購(gòu)于TaKaRa公司；IPTG購(gòu)于 Merck公司；多聚甲醛購(gòu)于 Sigma公司。

1.2 表達(dá)載體構(gòu)建

在 GenBank查得此基因序列信息，用 BioEdit軟件分析其疏水性和抗原性，選取aa886-936這一段作為免疫家兔的抗原。以購(gòu)買(mǎi)的 pCMV-SPORT6-PHF8載體為模板，用上游引物 (5′-cgGAATTCgcaaaa gaagaaatatatc-3′) 和下游引物 (5′-tacgGTCGACttcact caggaggaggcagggg-3′) PCR擴(kuò)增 PHF8 (aa886-936)片段。擴(kuò)增條件為：94℃ 1 min， 55℃ 45 s，72℃ 20 s，24個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后和pET41b載體分別經(jīng)EcoR I和Sal I雙酶切并回收。回收的載體和片段經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化入E. coli Top10菌株。挑取的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序證實(shí)為所要的克隆。

1.3 抗原蛋白的表達(dá)與純化

將以上構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E. coli BL21菌株。用終濃度0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)GST融合蛋白表達(dá)。離心收集菌體后用10倍菌體積的PBS將其重懸，在終濃度2 mmol/L PMSF下超聲裂解。裂解液經(jīng)12 000 × g，4℃離心10 min后取上清。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白在 N端帶有 GST標(biāo)簽，可以用 Glutathione Sepharose 4B微珠親和純化。將適量 Glutathione Sepharose 4B微珠加入上清中，4℃結(jié)合4 h后，用10倍微珠體積的PBS洗去非特異性結(jié)合。洗過(guò)的微珠用100 mmol/L的谷胱甘肽4℃洗脫。洗脫下的蛋白用PBS透析后經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)其純度和濃度，符合要求即可用于家兔的免疫。

1.4 兔抗PHF8蛋白抗體血清的制備

將上述抗原混入同等體積的弗氏完全佐劑免疫家兔。雌性家兔背部皮下取三點(diǎn)注射，每次免疫使用抗原0.5 mg，體積1 mL。每隔2周免疫1次，免疫3次后用間接ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)。效價(jià)符合要求后按常規(guī)方法采集血清，血清中加入 0.01%的疊氮化鈉分裝，?20℃保存。

1.5 抗體親和純化

CNBr活化Sepharose 4B微珠各400 μL分別結(jié)合GST蛋白和GST-PHF8 (aa886-936) 融合蛋白形成共價(jià)偶聯(lián)。偶聯(lián)后的微珠用于后續(xù)的親和純化。

首先用Sepharose 4B-GST微珠除去抗血清中的GST抗體。400 μL微珠加入6 mL兔抗血清在純化柱中4℃孵育過(guò)夜，然后過(guò)柱子收集上清用于下一步純化。Sepharose 4B-GST柱子用100 mmol/L甘氨酸(pH 2.7) 洗脫GST抗體之后按說(shuō)明書(shū)以高鹽緩沖液和低鹽緩沖液平衡。收集的上清再次通過(guò)平衡后的柱子以徹底除去血清中的GST抗體。

除去抗血清中的GST抗體后，再用CNBr活化的Sepharose 4B-GST-PHF8 (aa886-936) 微珠親和純化其中的PHF8抗體。室溫下將該上清 3次通過(guò)400 μL柱子，使其中的PHF8抗體與微珠上共價(jià)偶聯(lián)的抗原充分結(jié)合。然后 10倍體積 PBS過(guò)柱子 3次除去非特異性結(jié)合。再用3 mL pH 2.7的100 mmol/L甘氨酸洗脫P(yáng)HF8抗體，600 μL分裝1管。最后用pH 8.0的Tris-HCl調(diào)pH至7.0，加入0.01%的疊氮化鈉4℃保存。

1.6 免疫印跡法檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pFLAG-CMV2-PHF8過(guò)表達(dá)FLAG-PHF8蛋白以及pFLAG-CMV2空載體的293T細(xì)胞裂解液和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 293T細(xì)胞裂解液SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜之后進(jìn)行Western blotting實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，一抗為純化得到的抗體，二抗為帶辣根過(guò)氧化物酶的羊抗兔抗體。

1.7 免疫熒光染色檢測(cè)

將 HeLa細(xì)胞置于玻片上，24 h后收樣，PBS洗過(guò)之后用4%多聚甲醛室溫固定10 min。固定后的細(xì)胞用1%TritonX-100 PBS打孔1 min，然后以10%山羊血清0.5%NP-40 PBS室溫封閉1 h。隨后一抗37℃室溫孵育1 h，熒光二抗避光室溫孵育1 h。最后DAPI染色后封片在熒光顯微鏡下觀察。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 抗原蛋白的制備

將構(gòu)建好的 pET41b-PHF8 (aa886-936) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21工程菌株，擴(kuò)大化培養(yǎng)。菌體經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后取樣進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明該融合蛋白表達(dá)正常。將菌體超聲裂解后取上清，加入適量 Glutathione Sepharose 4B微珠進(jìn)行親和純化，獲得純度較高的GST融合蛋白。獲得的蛋白溶液經(jīng)透析之后取5 μL樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，結(jié)果表明已制得純度和濃度都較高的融合蛋白 (圖1)。

2.2 抗血清的獲得

將純化后的抗原加入等體積弗氏完全佐劑，免疫家兔。3次免疫之后血清采樣用于ELISA檢測(cè)。結(jié)果表明免疫 2只家兔獲得的抗血清效價(jià)均大于100 000，效價(jià)較高。

2.3 PHF8抗體親和純化

通過(guò) GST-Sepharose 4B微珠除去抗血清中的GST抗體之后，結(jié)合在 Sepharose 4B微珠上的GST-PHF8 (aa886-936) 抗原特異性地和抗血清中的PHF8抗體相結(jié)合。用3 mL的pH 2.7的甘氨酸洗脫P(yáng)HF8抗體，每600 μL分裝1管。每管分別取1 μL樣進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色(圖 2)。染色結(jié)果表明通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到了純度較高的PHF8抗體，其中第2管的純度和濃度都最高。

2.4 純化抗體的免疫印跡檢測(cè)

為檢測(cè)純化抗體的特異性，取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pFLAG-CMV2-PHF8過(guò)表達(dá)PHF8蛋白的293T細(xì)胞裂解液和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的293T細(xì)胞裂解液，用制得的抗體進(jìn)行免疫印跡檢測(cè)。制得的抗體分別檢測(cè)到了內(nèi)源以及外源過(guò)表達(dá)的 PHF8蛋白，條帶清晰，表明抗體具有很好的特異性 (圖3)。

2.5 免疫熒光染色

將 HeLa細(xì)胞置于玻片上再轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 pFLAGCMV2-PHF8，收樣后依照上述方法分別以 FLAG抗體和PHF8抗體為一抗進(jìn)行免疫熒光染色分析。未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 HeLa細(xì)胞也同樣固定進(jìn)行了染色分析。結(jié)果顯示PHF8蛋白廣泛分布在細(xì)胞核中，并在某些區(qū)域形成致密的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu) (圖 4)。PHF8抗體和FLAG抗體所得到的結(jié)果一致，而兔IgG染色未檢測(cè)到信號(hào)，也表明制得的抗體具有很好的特異性。

圖1 GST-PHF8 (aa886-936) 蛋白的純化Fig. 1 Purification of GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein. M: protein marker; 1: GST protein; 2: GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein; 3?9: BSA proteins, they were loaded in the order of 0.5 μg, 1.0 μg, 2.0 μg, 2.5 μg, 3.0 μg and 3.5 μg.

圖2 親和純化后的PHF8抗體Fig. 2 Affinity Purified PFH8 antibody. M: protein marker; 1?5: purified PHF8 antibody, elution 1 to 5; 6?9: BSA proteins were loaded in the order of 1 μg, 2 μg, 3 μg and 4 μg.

圖3 免疫印跡檢測(cè)293T細(xì)胞中的PHF8蛋白Fig. 3 Detection of PHF8 protein in 293T cells by Western blotting. 1: cell lysate from 293T cells transfected with pFLAG-CMV2-PHF8; 2: 293T cells transfected with pFLAG-CMV2; 3: 293T cell lysate.

圖4 純化的抗體以及FLAG抗體對(duì)PHF8的免疫熒光染色Fig. 4 Immunofluorescence of PHF8 protein in HeLa cells with purified antibody. 1: HeLa cells were transfected with pFLAG-CMV2-PHF8 and immunostained with FLAG antibody as a positive control; 2: HeLa cells were transfected with pFLAG-CMV2-PHF8 and immunostained with PHF8 antibody; 3: HeLa cells were immunostained with Rabbit IgG as a negative control; 4: HeLa cells were immunostained with PHF8 antibody. Nuclei were labeled with DAPI (blue).

3 討論

為研究 PHF8蛋白的功能，本實(shí)驗(yàn)以免疫家兔獲得抗血清，再親和純化抗血清制備 PHF8多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)所選取的抗原具有較好的免疫原性和親水性，免疫家兔得到了效價(jià)較高的抗血清。抗血清的成分比較復(fù)雜，直接用于實(shí)驗(yàn)往往非特異性信號(hào)較多而影響觀察。為得到高特異性的抗體，需要對(duì)抗血清中的抗體進(jìn)行純化。

實(shí)驗(yàn)室一般使用膜純化、柱純化或者分級(jí)沉淀[14]的方法進(jìn)行親和純化。膜純化是較早出現(xiàn)的一種方法[15]，即將抗原通過(guò)SDS-PAGE電泳之后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后使膜和抗血清充分結(jié)合使抗血清中的抗體和膜上的抗原在膜上形成復(fù)合物，再將結(jié)合到膜上的抗體洗脫下來(lái)。這種方法由于抗原量的限制，得到的抗體量較少，而且抗原也可能從硝酸纖維膜上洗脫下來(lái)?yè)饺肟贵w之中，影響抗體的純度。柱純化因使用填料的種類(lèi)也分為不同的類(lèi)型。如使用A蛋白珠子[16]結(jié)合抗血清中的抗體進(jìn)行初步的純化?；蛘呤褂?Sepharose微珠[17]結(jié)合抗原作為填料以增加抗體的特異性。但這種方法里微珠和抗原也是以氫鍵、疏水堆積等作用力結(jié)合，與抗原抗體結(jié)合作用力類(lèi)似，因而對(duì)洗脫抗體的條件要求較苛刻，否則抗原依然會(huì)一起洗脫下來(lái)。柱純化的方法能制得大量的抗體，其難點(diǎn)在于提高抗體的純度。

本實(shí)驗(yàn)中使用CNBr活化Sepharose 4B微珠[18]作為填料進(jìn)行柱純化。抗原能和這種微珠形成穩(wěn)定的共價(jià)結(jié)合，因而不會(huì)隨抗體一起洗脫下來(lái)。這種方法不僅提高了抗原的純度，也能使抗體更徹底地洗脫下來(lái)，提高了抗體的總量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)這種方法得到了大量 PHF8多克隆抗體，并用免疫印跡的方法驗(yàn)證其特異性。用該抗體進(jìn)行免疫熒光染色的結(jié)果則表明 PHF8蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。它在核內(nèi)有著廣泛的分布，并在某些地方形成致密的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。制得高特異性抗體為 PHF8蛋白的功能研究打下了良好的基礎(chǔ)。

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Preparation, purification and identification of the polyclonal antibody of PHD finger protein 8

Rong Cai, and Xin Ye
Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

PHD finger protein 8 (PHF8) is a novel protein with PHD domain and Jmjc domain, which may play important role in regulating transcription and histone demethylation. It is necessary to generate the antibody against PHF8 in order to further study its biological function. First we constructed plasmid pET41b-PHF8 (aa886-936) and expressed the GST-PHF8 (aa886-936) fusion protein in Escherichia coli BL21. We then purified the fusion protein by Glutathione Sepharose 4B beads and subjected to immunize the rabbits for acquiring antiserum. We obtained PHF8 polyclonal antibody by affinity purifying the antiserum with CNBr-activated Sepharose 4B beads. The antibody was effective in Western blotting and immunofluorescence with high specificity. Immunofluorescence also showed that PHF8 protein was located in nucleus in HeLa cells.

PHF8, polyclonal antibody, affinity purification

為維持生物體正常的結(jié)構(gòu)與功能，細(xì)胞分裂以一個(gè)周期的形式有序進(jìn)行。多種蛋白參與這一過(guò)程的調(diào)控，以維持細(xì)胞周期的正常穩(wěn)定。Cdk2 (細(xì)胞周期素依賴(lài)激酶2) 在G1期到S期的轉(zhuǎn)換中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[1]。它與細(xì)胞周期素Cyclin E結(jié)合，通過(guò)磷酸化下游一系列底物如Rb、NPAT、Cdc6等，啟動(dòng)DNA的合成，使細(xì)胞不可逆地進(jìn)入S期[2]。前期的工作表明PHD finger 8 (PHF8)蛋白和Cdk2存在相互作用[3]。PHF8是最新發(fā)現(xiàn)的含有 PHD[4-7]和Jmjc[8-10]結(jié)構(gòu)域的蛋白。目前的研究表明這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能和組蛋白去甲基化以及基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。目前在神經(jīng)發(fā)育遲緩病例中發(fā)現(xiàn)其多種突變體的存在[11-12]，最新研究發(fā)現(xiàn)其具有去甲基化的功能[13]。為了研究 PHF8蛋白在細(xì)胞中的定位，也為進(jìn)一步功能研究奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)制備了 GST-PHF8 (aa886-936) 融合蛋白作為抗原免疫家兔獲取抗血清，并通過(guò)CNBr活化Sepharose 4B微珠親和純化抗血清得到了 PHF8特異性多克隆抗體。該抗體用于PHF8蛋白的Western blotting檢測(cè)以及在HeLa細(xì)胞的免疫熒光染色。

November 2, 2009; Accepted: January 7, 2010

Supported by:National Nature Science Foundation of China (No. 30771098).

Xin Ye. Tel: +86-10-64807508; E-mail: yex@im.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (No. 30771098) 資助。