南美蟛蜞菊毛狀根誘導及其離體培養(yǎng)

歐少云，施和平，曾寶強

1 華南師范大學生命科學學院廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣州 510631

2 清遠職業(yè)技術學院，清遠 511510

3 香港教育學院科學與環(huán)境學系，香港新界

利用發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacterium rhizogenes Ri質(zhì)粒的T-DNA片段在植物基因組中的插入、整合和表達所產(chǎn)生的生長迅速的毛狀根培養(yǎng)物來產(chǎn)生植物尤其是藥用植物的次生物質(zhì)，已在人參Panax ginseng L.、褐脈少花龍葵Solanum nigrum L. var. pauciflorum、三裂葉野葛Pueraria phaseoloides L.和Ruta graveolens L.等藥用植物中獲得成功[1-4]；同時由于 Ri質(zhì)粒 TDNA的rol基因誘導產(chǎn)生的毛狀根再生成植株具有諸如矮化、莖節(jié)數(shù)減少、花序縮短、開花延遲等特征[5]；因而國內(nèi)外已有不少學者在開展利用毛狀根技術來改良植物觀賞性狀，嘗試培育諸如矮化、花葉形態(tài)改變的新品種[6-7]。南美蟛蜞菊 Wedelia trilobata (L.) A.S.Hitche，別名三裂葉蟛蜞菊、屬菊科多年生草本，花黃色且全年見花。有研究表明，南美蟛蜞菊含有具有化感作用的倍半萜內(nèi)酯成分[8]；同時它也是良好的耐陰地被植物和護坡好材料；但在用作園林綠化的地被植物使用時，由于其生長較快，節(jié)間長，必須定期進行人工修剪。因而，園藝生產(chǎn)上也迫切需要開發(fā)出矮化、節(jié)間顯著縮短的南美蟛蜞菊品種來用作“地被”植物進行廣場和坡地綠化種植。而有關南美蟛蜞菊的組織培養(yǎng)研究雖有少量報道[9]，但到目前為止，未見利用發(fā)根農(nóng)桿菌對南美蟛蜞菊遺傳轉化及其毛狀根次生物質(zhì)產(chǎn)生和植株再生的研究報道。為此，本研究擬通過發(fā)根農(nóng)桿菌對南美蟛蜞菊葉片的遺傳轉化，產(chǎn)生出可自主生長的毛狀根，并研究該毛狀根液體培養(yǎng)周期中蔗糖、無機元素N、P和Ca的消耗變化，為今后利用該毛狀根的離體培養(yǎng)來生產(chǎn)具有化感作用的次生物質(zhì)，以及通過毛狀根的組織培養(yǎng)來快速繁殖出矮化的、無需修剪的南美蟛蜞菊新品種等奠定實驗和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 細菌菌株及培養(yǎng)

農(nóng)桿堿型發(fā)根農(nóng)桿菌 ATCC15834由德國馬丁.路德大學的Peter Lindemann博士提供。挑取該農(nóng)桿菌單菌落，接種于添加了20 μmol/L 乙酰丁香酮的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩 (160 r/min) 培養(yǎng)30 h后，供感染用。

1.2 外植體的制備

取南美蟛蜞菊植株的幼嫩葉片，在超凈工作臺上經(jīng)70%酒精和0.1% HgCl2溶液常規(guī)消毒后，切成1 cm2左右具葉脈的葉片外植體，接種于無外源激素的MS培養(yǎng)基預培養(yǎng)24 h后，用于轉化。

1.3 毛狀根的誘導和培養(yǎng)

將上述預培養(yǎng)的葉片外植體浸入用MS培養(yǎng)基稀釋 5倍的發(fā)根農(nóng)桿菌 ATCC15834菌懸液中15 min，取出、吸干多余菌液并放回原培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d后，轉入MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉的無外源激素的MS培養(yǎng)基上，在25℃每天14 h散射光下誘導毛狀根。切取從外植體產(chǎn)生的毛狀根置于含500 mg/L頭胞噻肟鈉的無外源激素的MS培養(yǎng)基上進行單根除菌培養(yǎng)，直到獲得無菌的毛狀根。

1.4 毛狀根的PCR檢測

取能在無外源激素的培養(yǎng)基上快速自主生長的無菌毛狀根500 mg，按Ewards等[10]的方法提取毛狀根基因組DNA，純化后用作PCR擴增的模板。以南美蟛蜞菊非轉化植株根的基因組總 DNA作對照。根據(jù)Furner等[11]發(fā)表的序列，設計并合成擴增rol B、rol C的PCR引物。根據(jù)Choi等[12]發(fā)表的序列設計并合成擴增vir C的PCR引物。Rol B引物：P1: 5'-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3'，P2:5'-GAA GGTGCAAGCTA CCTCTC -3'；rol C引物：P1:5'-CTC CTG ACA TCA AAC TCG TC-3'，P2:5'- TGC TTC GAG TTA TGG GTA CA-3'；vir C引物：P1:5'-GGC TTC GCC AAC CAA TTT GGA GAT-3'；P2:5'-TTT TGC TCC TTC AAG GGA GGT GCC-3' (引物由中國科學院上海細胞生物研究所合成)。

在0.2 mL的硅化離心管中加入50 ng模板DNA，Taq DNA聚合酶2個單位，PCR反應總體積為50 μL。PCR擴增參數(shù)如下：rol B、rol C基因擴增條件相同，其PCR擴增的反應參數(shù)為：94℃熱變性3 min；94℃變性1 min，53.5℃退火1 min和72℃延伸反應1 min，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。vir C基因的擴增條件為，94℃熱變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s和72℃延伸反應2 min，進行30個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。擴增產(chǎn)物采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和EtBr染色進行分析。

1.5 培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基蔗糖、硝態(tài)氮、無機磷、Ca2+含量的變化

將來自同一克隆系的生長旺盛的南美蟛蜞菊毛狀根，切成長4~5 cm、具根尖的毛狀根根段，接入盛有滅菌的 MS液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。起始接種量約為0.1 g FW/瓶，在為期42 d的培養(yǎng)過程中，每隔7 d隨機抽取毛狀根培養(yǎng)物3瓶；收取毛狀根，用無菌水沖洗后、用濾紙吸干毛狀根培養(yǎng)物表面的水分后測定其生物量。將毛狀根取樣后的 MS培養(yǎng)液過濾、去離子水定容后，供測定培養(yǎng)基殘余的蔗糖、硝態(tài)氮、無機磷和 Ca2+的含量變化用。其中，培養(yǎng)基中蔗糖含量的測定、硝態(tài)氮含量的測定、無機磷含量的測定按照文獻[13]的方法；培養(yǎng)液中Ca2+濃度的 EDTA絡合滴定按照文獻[14]的方法。實驗重復測定3次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 南美蟛蜞菊毛狀根的誘導和培養(yǎng)

未感染的南美蟛蜞菊幼嫩葉片外植體在無外源激素的MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)25 d后無一生根，僅可見大部分的葉片外植體邊緣變黃或變褐；僅個別葉片外植體的形態(tài)學下端切口中脈處產(chǎn)生少量淺黃綠色致密的愈傷組織。而感染發(fā)根農(nóng)桿菌的葉片外植體培養(yǎng)7 d后，從其葉片切口中脈處或附近表面產(chǎn)生毛狀根 (圖 1A)，或從葉脈處產(chǎn)生的淺黃綠色愈傷組織上產(chǎn)生毛狀根；當從葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根置于光下培養(yǎng)10 d后，毛狀根不僅快速生長，而且根呈紫紅色 (圖1B)。將所產(chǎn)生的毛狀根切下并置于 MS+500 mg/L頭胞噻肟鈉中單根除菌培養(yǎng)，每隔7 d左右轉接1次，約5~6次后即可完全除菌。無菌毛狀根可在無外源激素的 MS固體或液體培養(yǎng)基上快速自主生長，且具較多分枝 (圖1C)。所獲得的可自主快速生長的毛狀根置于無外源激素的 MS培養(yǎng)基中繼代保存，供進行遺傳轉化鑒定用。

2.2 毛狀根中rol基因的PCR擴增

圖1 發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834誘導南美蟛蜞菊葉片外植體產(chǎn)生的毛狀根及其培養(yǎng)Fig. 1 Hairy roots induced from leaf explants of W. trilobata after infection with A. rhizogenes ATCC15834 and its in vitro culture. (A) Hairy roots induced from leaf explants 10 days after infection. (B) Hairy roots from leaf explants cultured under light. (C) Hairy roots by liquid culture.

圖2 南美蟛蜞菊毛狀根vir C、rol B和rol C基因的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳分析Fig. 2 Gel electrophoresis analysis of PCR fragments of vir C, rol B and rol C genes amplified from the genomic DNA of W. trilobata hairy roots. 1: 1 kb DNA marker; 2, 6, 9: fragments amplified from the cells of A.rhizogenes ATCC15834. 3, 5, 8: fragments amplified from untransformed roots. 4, 7, 10: fragments amplified from hairy roots.

rol B 和 rol C 是發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒TL-DNA(T-DNA 左臂) 上的兩個生根基因，而vir C是Ri質(zhì)粒中僅參與T-DNA轉化過程但其本身并不整合進植物基因組中的毒性基因之一。本實驗中，采用對毛狀根基因組DNA進行vir C基因的PCR擴增，以確保毛狀根的除菌效果。以vir C、rol B和rol C的引物分別從南美蟛蜞菊非轉化根 (自然根)、毛狀根基因組 DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌單菌落擴增產(chǎn)物的電泳結果如圖2。從圖2可見，利用rol B和rol C的PCR引物能從南美蟛蜞菊毛狀根的總 DNA及發(fā)根農(nóng)桿菌 ATCC15834 單菌落克隆中分別擴增到期望的540 bp和770 bp左右的特異性DNA片段，而從南美蟛蜞菊非轉化根的總 DNA中擴增不到任何片段。而以vir C引物僅能從發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834單菌落中擴增出約650 bp的條帶，而不能從南美蟛蜞菊非轉化根和毛狀根中擴增出任何片段。這說明，發(fā)根農(nóng)桿菌含rol基因的RiT-DNA部分已在南美蟛蜞菊毛狀根基因組中整合并得到表達。

2.3 南美蟛蜞菊毛狀根的生長特性

將經(jīng)遺傳轉化鑒定為陽性的南美蟛蜞菊無菌毛狀根接種至液體MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)1~2 d后，可觀察到從毛狀根根段開始產(chǎn)生出新的乳白色分枝根；而且隨著培養(yǎng)時間的延長，根段不斷伸長；同時發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)的進行，毛狀根的顏色逐漸由白色變?yōu)闇\紫色，較老部分呈綠色；培養(yǎng)28 d后，還可觀察到小部分毛狀根的起始根段處開始出現(xiàn)局部輕微褐化；35 d后，毛狀根變得纖細，老化明顯加重，色澤變暗，呈現(xiàn)墨綠色。圖3為南美蟛蜞菊毛狀根在液體培養(yǎng)過程中的生長變化曲線。從圖3可見，南美蟛蜞菊毛狀根的生長曲線基本符合“S”型。0~7 d內(nèi)處于生長遲滯期；7~21 d為快速生長期；21 d后進入生長減慢期；35 d后，毛狀根生物量增長呈下降的趨勢，此時還可觀察到大部分毛狀根表面出現(xiàn)不同程度地褐化，并發(fā)現(xiàn)在毛狀根培養(yǎng)過程中可能不斷向培養(yǎng)基中分泌次生代謝產(chǎn)物，并最終使培養(yǎng)基顏色由開始時的無色逐漸變成黃綠色。

圖3 南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)生長曲線Fig. 3 Growth curve of W. trilobata hairy roots cultured in liquid MS medium.

2.4 毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基蔗糖濃度的消耗變化

圖4為南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基蔗糖的消耗變化。從圖 4可見，在毛狀根液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中蔗糖被快速吸收和利用，表現(xiàn)在其濃度急劇下降；培養(yǎng)至7 d時，培養(yǎng)基中蔗糖被消耗近50%；而隨著培養(yǎng)時間的延長培養(yǎng)基的蔗糖濃度不斷降低；培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基的蔗糖濃度僅約為其起始濃度的 3.39%。這表明對南美蟛蜞菊毛狀根生長而言，其培養(yǎng)基中的蔗糖代謝較快，其代謝周期約為35 d左右。

2.5 毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基 NO3?-N的消耗變化

圖4 南美蟛蜞菊液體培養(yǎng)過程蔗糖的消耗變化Fig. 4 Changes of sucrose content in the medium during liquid culture of W. trilobata hairy roots.

圖5 南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中硝態(tài)氮含量的變化Fig. 5 Changes of NO3?-N content in the medium during liquid culture of W. trilobata hairy roots.

圖5為南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中NO3?-N的消耗變化。從圖5可見，在毛狀根液體培養(yǎng)的0~7 d內(nèi)，培養(yǎng)基中硝態(tài)氮被迅速消耗；培養(yǎng)至7 d，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量約為其起始硝態(tài)氮含量的5.8%；而培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量降到最低，約0.01 mg/mL，約為培養(yǎng)基起始硝態(tài)氮含量的1.82%，而此時毛狀根的生物量 (鮮重)也達到最大；但培養(yǎng)35 d以后，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量又呈略升高的趨勢，至結束培養(yǎng)時培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量僅約為起始濃度的 4.28%。該結果表明，在液體搖瓶培養(yǎng)時，南美蟛蜞菊毛狀根對硝態(tài)氮的利用迅速，其培養(yǎng)基硝態(tài)氮的代謝周期約為35 d。

2.6 毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基 Ca2+的消耗變化

圖6為南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基Ca2+的代謝變化。從圖6可見，培養(yǎng)基中Ca2+濃度隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低，但與培養(yǎng)基硝態(tài)氮的消耗變化相比，毛狀根對 Ca2+的吸收和利用速度相對較慢且不完全；培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基中仍殘存有占起始濃度約61.3%的Ca2+。這表明，雖然鈣是南美蟛蜞菊毛狀根生長所必需的礦質(zhì)元素，但它對鈣的吸收和利用要比氮源 (硝態(tài)氮) 慢得多。

2.7 毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基無機磷的消耗變化

圖7為南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基無機磷的代謝變化。從圖 7可見，培養(yǎng)基的無機磷被快速消耗，其濃度急劇下降；培養(yǎng) 7 d后，培養(yǎng)基的無機磷濃度只約為其起始濃度的 1.76%；這表明在液體培養(yǎng)過程中毛狀根對無機磷的吸收和代謝很快；而在隨后的培養(yǎng)時間內(nèi)，培養(yǎng)基的無機磷濃度變化不大。這表明與硝態(tài)氮一樣，無機磷是南美蟛蜞菊毛狀根生長所必需的礦質(zhì)元素，而且毛狀根對磷的吸收和利用要比Ca2+快得多。

圖6 南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基鈣含量的變化Fig. 6 Changes of Ca2+ content in the medium during liquid culture of W. trilobata hairy roots.

圖7 毛狀根液體培養(yǎng)過程培養(yǎng)液中無機磷含量的變化Fig. 7 Changes of phosphorus content in the medium during liquid culture of W. trilobata hairy roots.

3 討論

利用發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒的遺傳轉化產(chǎn)生生長迅速的毛狀根，已在人參 P. ginseng、褐脈少花龍葵S. nigrum L. var. pauciflorum和三裂葉野葛P. phaseoloides等多種植物中獲得成功[1-3]。但至今為止，未見有關利用發(fā)根農(nóng)桿菌對南美蟛蜞菊遺傳轉化獲得毛狀根的正式報道。在本實驗中，利用含野生農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒的發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834對南美蟛蜞菊的遺傳轉化，獲得了能在無激素培養(yǎng)基上自主生長的毛狀根，而且發(fā)現(xiàn)所獲得的離體培養(yǎng)毛狀根提取物中分離到可抑制多種種子萌發(fā)的具有化感作用的物質(zhì) (另文發(fā)表)；同時，所獲得的毛狀根為接下來通過毛狀根組織培養(yǎng)途徑繁殖出具矮化等性狀的、無需修剪的南美蟛蜞菊新品種奠定了實驗和技術基礎。此外，在本實驗中觀察到，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感染南美蟛蜞菊葉片外植體后，毛狀根可從葉片外植體的葉脈切口處直接產(chǎn)生，或從切口處形成的淺黃綠色愈傷組織上產(chǎn)生。然而，Bercetche等報道，被發(fā)根農(nóng)桿菌感染后，發(fā)現(xiàn)毛狀根僅從胡蘿卜塊根外植體的愈傷組織及煙草莖段外植體形成的愈傷組織上產(chǎn)生[15]；但也有報道表明，馬鈴薯Solanum tuberosum L.的毛狀根可從其葉片和塊莖外植體切口處直接產(chǎn)生，但其莖段外植體被發(fā)根農(nóng)桿菌感染后，毛狀根只從莖段外植體的愈傷組織上產(chǎn)生[16]，這與本實驗的結果不一致。在本實驗中，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感染南美蟛蜞菊葉片外植體后，毛狀根可從葉片外植體的葉脈切口處直接或從形成的淺黃綠色愈傷組織上再產(chǎn)生出毛狀根。而這種差異的產(chǎn)生可能與植物的類型及所取的外植體的類型等有關。

研究培養(yǎng)基中主要營養(yǎng)元素的代謝變化是建立和確定南美蟛蜞菊毛狀根的最佳離體培養(yǎng)條件及利用該毛狀根進行藥用次生代謝物質(zhì)生產(chǎn)的前提和基礎。蔗糖作為毛狀根培養(yǎng)基中最常用的碳源和能源，以往的研究幾乎都集中在研究培養(yǎng)基的蔗糖濃度對毛狀根生長及其次生代謝物積累的影響，而對毛狀根培養(yǎng)過程中蔗糖本身的代謝或消耗速率的變化與毛狀根生長的關系研究較少[17-18]。在何首烏Polygonium multiflorum Thunb毛狀根培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中蔗糖的消耗變化與毛狀根的生長速率呈正相關[17]。而胡之璧等在培養(yǎng)丹參Salvia miltiorrhiza Bge毛狀根時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的蔗糖在16 d內(nèi)消耗完畢[18]。此外，在玫瑰茄Hibiseus sabdariffa L.細胞懸浮培養(yǎng)時也發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的蔗糖在培養(yǎng)至16 d時已全部被吸收利用[19]。而三裂葉野葛毛狀根液體培養(yǎng)0~4 d的生長停滯期內(nèi)，培養(yǎng)基的蔗糖被消耗了極少部分，但在培養(yǎng)4~16 d的毛狀根生長時期，培養(yǎng)基的蔗糖被迅速消耗；培養(yǎng)至16 d時幾乎被消耗完畢[20]，而這與本實驗的結果類似。在本實驗中，培養(yǎng)基的蔗糖被快速吸收和利用，培養(yǎng)至 7 d時，培養(yǎng)基中蔗糖被消耗近50%；而隨著培養(yǎng)時間的延長培養(yǎng)基的蔗糖濃度不斷降低；培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度僅約為其起始濃度的3.39%。然而，在培養(yǎng)火焰菜Beta vulgaris L.毛狀根時發(fā)現(xiàn)，在接種后3 d內(nèi)，毛狀根還處于生長停滯期時，培養(yǎng)基的蔗糖就會被迅速消耗，其蔗糖濃度急劇下降，降幅達50%[21]。而郭志剛等在培養(yǎng)栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.毛狀根時也發(fā)現(xiàn)，接種后3~4 d的生長停滯期內(nèi)，毛狀根的生物量積累雖很小，但其培養(yǎng)基中的蔗糖濃度卻快速下降[22]。這顯然與本實驗的結果不一致。作者認為，這種差異的產(chǎn)生說明培養(yǎng)基的蔗糖消耗可因植物種類和培養(yǎng)體系的不同而有所差別。

硝態(tài)氮是毛狀根培養(yǎng)基中最重要的氮源之一。迄今為止，關于培養(yǎng)基中氮源 (硝態(tài)氮和銨態(tài)氮) 的含量或種類及其配比對毛狀根的生長及其次生代謝產(chǎn)物的影響已有一些研究報道[23-25]。如高濃度氮會抑制總黃酮合成，而硝態(tài)氮在總氮中含量大于50%時更有利于水母雪蓮Saussurea medusa Maxim毛狀根的生長和次生物質(zhì)總黃酮的積累[23]。而且發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中硝態(tài)氮和銨態(tài)氮的比率還能明顯影響顛茄Atropa belladonna L.毛狀根的生長及其次生物質(zhì)東莨菪堿/天仙子胺的比率；而降低培養(yǎng)基的硝態(tài)氮濃度還可促進毛狀根中生物堿的產(chǎn)生[24]。此外，在培養(yǎng)基中添加NO3?能使Datura candida × D. aurea毛狀根的生物量增加及顯著提高天仙子胺生物堿的含量，但同時會使毛狀根的東莨菪堿 (Scopolamine)含量明顯降低[25]?？梢?，培養(yǎng)基的氮含量是影響毛狀根生長及其代謝的一個非常重要的因素。然而，相比之下，對毛狀根培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基氮源本身的消耗速率與毛狀根生長的關系的研究較少。在培養(yǎng)栝樓T. kirilowii毛狀根時，培養(yǎng)基中銨態(tài)氮和硝態(tài)氮隨著生長的進行而被逐漸消耗，在培養(yǎng)24 d時銨態(tài)氮已被完全消耗，而此時仍有17%的硝態(tài)氮未被消耗和利用[22]；然而，在高山紅景天 Rhodiola Sachalinensis A. Bor. 細胞懸浮培養(yǎng)中卻觀察到，其培養(yǎng)基中 NO3?/NH4+濃度比幾乎為一恒定值[26]。而三裂葉野葛毛狀根液體培養(yǎng)20 d后，其培養(yǎng)基的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮均被消耗殆盡[20]。而這些與本實驗的結果不完全一致。在本實驗中，在南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)的0~7 d內(nèi)，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮被迅速消耗；培養(yǎng)至7 d時，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量只剩下起始硝態(tài)氮含量的5.8%；而培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量降到最低，約0.01 mg/mL，約占培養(yǎng)基起始硝態(tài)氮含量的1.82%；但培養(yǎng)35 d以后，培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮含量又呈略升高的趨勢，至結束培養(yǎng)時培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量約占起始濃度的 4.28%。而這種差異的產(chǎn)生可能與毛狀根的類型及植物種類等有關。而在毛狀根生長達到高峰以后，培養(yǎng)基的硝態(tài)氮含量出現(xiàn)回升，這可能與毛狀根的老化導致細胞死亡自溶并向培養(yǎng)液釋放硝態(tài)氮有關。

與氮一樣，磷(P) 也是毛狀根生長發(fā)育及其次生代謝調(diào)節(jié)的必需元素，它的消耗變化或供給狀態(tài)可反映或影響毛狀根的生長和代謝狀況。目前對于可離體自主生長的毛狀根而言，有關其培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基磷的消耗變化已有少量研究報道。如三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)16 d 時培養(yǎng)基中的PO43?被消耗殆盡[20]。而在培養(yǎng)長春花Catharanthus roseus L.毛狀根時發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的磷酸鹽在培養(yǎng)8 d后就被全部消耗完畢[27]。而王玉春等[28]發(fā)現(xiàn)，在青蒿Artemisia annua L.毛狀根的液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和磷酸鹽的消耗變化都與毛狀根的生長成正相關，其中尤以磷酸鹽的消耗最快，約在接種后15 d被完全吸收。而這與本實驗的結果不完全一致。在本實驗中，南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的無機磷被快速消耗，其濃度急劇下降，培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基的無機磷濃度就下降至只約為其起始濃度的 1.76%，表明南美蟛蜞菊毛狀根對磷的代謝很快。

與磷一樣，鈣也是植物細胞生長發(fā)育必需的礦質(zhì)元素之一。有研究表明，培養(yǎng)基中的 Ca2+濃度或Ca2+拮抗劑等能提高水蓼 Polygonum hydropiper L.懸浮細胞黃酮醇的產(chǎn)量[29]或促進長春花C. roseus L.毛狀根中吲哚生物堿的產(chǎn)生和釋放[27]。而在三裂葉野葛毛狀根培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基的 Ca2+可被毛狀根逐漸吸收和利用，但與培養(yǎng)基的磷酸鹽、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的消耗變化相比，毛狀根對 Ca2+的吸收速度慢且利用不完全[20]。而這與本實驗的結果類似。在本實驗南美蟛蜞菊毛狀根液體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的 Ca2+含量也呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，但毛狀根對Ca2+的吸收和利用速度相對較慢且不完全；甚至培養(yǎng)至35 d時，培養(yǎng)基中仍殘存有占起始濃度約61.3%的Ca2+。

本實驗結果表明，培養(yǎng)基的蔗糖、硝態(tài)氮、磷、鈣離子的消耗變化可因植物毛狀根的種類和培養(yǎng)體系的不同而有所差別，而通過對培養(yǎng)基中蔗糖、硝態(tài)氮、磷、鈣離子的消耗變化的測定，將能為大規(guī)模培養(yǎng)毛狀根時確定培養(yǎng)周期以及整個培養(yǎng)周期中碳源、氮源、鈣鹽等的供給量提供理論依據(jù)和技術參數(shù)。本實驗結果為今后利用南美蟛蜞菊毛狀根的規(guī)模培養(yǎng)來生產(chǎn)具化學它感作用的次生物質(zhì)，以及通過毛狀根組培途徑快繁出節(jié)間縮短的矮化新品種奠定了實驗和技術基礎。

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