鍺對霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和多糖合成及氧化還原態(tài)的影響

魏明，楊超英，姜紹通

1 安徽工程科技學(xué)院生化系，蕪湖 241000

2 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，合肥 230009

霍山石斛 (Dendrobium huoshanense C.Z.J.cheng)屬于蘭科石斛屬，是名貴中草藥，產(chǎn)于安徽霍山及臨近地區(qū)，具有滋陰、清熱、生津、潤肺、止咳、清音明目等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，石斛多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[2]、抗白內(nèi)障活性[3]。由于霍山石斛自然繁殖能力很低，在自然條件下生長緩慢、生長周期長，加上人工大量采集，其自然資源已瀕臨滅絕。類原球莖是霍山石斛離體繁殖過程的中間形態(tài)，可由植株的不同部位誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有和植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能[4]，類原球莖本身可以增殖。由于霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)周期較長，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物常常發(fā)生褐變，導(dǎo)致細(xì)胞生長緩慢。提高霍山石斛類原球莖的細(xì)胞活力，加快其增殖是實現(xiàn)霍山石斛類原球莖大規(guī)模培養(yǎng)的基礎(chǔ)。

鍺可以調(diào)節(jié)植物的生長，保護(hù)細(xì)胞膜不受損傷，提高細(xì)胞的抗氧化能力[5]。通過研究二氧鍺對霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長和多糖合成的影響，分析細(xì)胞中還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD、CAT和POD等酶的活性變化以及細(xì)胞的氧化還原態(tài)變化與細(xì)胞生長、產(chǎn)物合成的關(guān)系，為解決霍山石斛類原球莖增殖緩慢問題奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

霍山石斛類原球莖由本實驗室誘導(dǎo)保存，在無激素固體MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，繼代周期為30 d，生長培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，其中微量元素、有機(jī)元素減半，大量元素：KNO330 mmol/L、KH2PO41.25 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.5 mmol/L和CaCl2·2H2O 4.5 mmol/L，蔗糖濃度為3%。

1.2 類原球莖懸浮培養(yǎng)條件

依據(jù)文獻(xiàn)[6]和[7]，取生長30 d的類原球莖接種于裝有60 mL液體培養(yǎng)基 (pH為5.8) 的250 mL三角瓶中，接種量為100 g (鮮重)/L；分別添加終濃度為0、1.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0 mg/L的二氧化鍺，置于搖床上 (110 r/min)，25℃±2℃下懸浮培養(yǎng)，光照周期為14 h/d，日光燈光強(qiáng)為40 μmol/m2·s。

1.3 細(xì)胞生長量和多糖測定

每隔6 d隨機(jī)取樣1次，用蒸餾水洗2次，再用濾紙吸干類原球莖表面的水分后稱重為濕重，把類原球莖置于60℃烘箱中烘至恒重為干重。提取多糖前，類原球莖先用蒸餾水洗2次，然后研碎用蒸餾水在 50℃~60℃水浴中提取 3次，收集水提液，加95%乙醇至乙醇濃度為80%過夜沉淀，最后收集沉淀。沉淀溶于蒸餾水中用savage法脫蛋白，并用苯酚-硫酸測定多糖[8](采用723分光光度計測定)。培養(yǎng)基中的多糖提取方法同上，總多糖為胞內(nèi)和胞外多糖之和。

類原球莖生物量=收獲類原球莖的總干重/接種時培養(yǎng)基體積 (g/L)；類原球莖的比生長速率(X為生物量，t為培養(yǎng)時間，dX/dt為類原球莖增殖速率)；多糖總產(chǎn)量=多糖總提取量/接種時培養(yǎng)基體積 (g/L)；細(xì)胞得率 YC/S=細(xì)胞增殖量 (干重)/蔗糖消耗量；多糖得率 YP/S=多糖增加量/蔗糖消耗量。

1.4 培養(yǎng)基中殘?zhí)?、硝酸鹽、細(xì)胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)測定

培養(yǎng)基中的殘?zhí)怯帽椒?硫酸法測定[8]，硝酸根離子用水楊酸-濃硫酸法測定[9](考慮到培養(yǎng)過程中水分的蒸發(fā)對測定的影響，在測定培養(yǎng)基中的各種成分時，保持培養(yǎng)基的體積為接種時的體積)?？扇苄赃€原糖用還原糖法測定[10]，可溶性蛋白質(zhì)用Bradford法測定[11]。

1.5 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD) 的活性采用 SOD試劑盒測定，單位 U/g；過氧化氫酶(CAT) 的活性采用CAT試劑盒測定，單位U/g；SOD和CAT試劑盒由南京建成生物研究所提供。過氧化物酶(POD) 活性以愈創(chuàng)木酚法測定：取5 g類原球莖(鮮重) 在冰浴中研碎，然后加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8)提取粗酶液。反應(yīng)總體積為 3 mL，其中底物為0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1.0 mL，H2O2(2%) 1.0 mL，粗酶液0.1 mL，pH 6.8磷酸鹽緩沖液0.9 mL，在470 nm下測定吸光值的變化。酶活力定義為：以每分鐘每克鮮重吸光度的變化0.01為一個酶活單位 (U/g)。

1.6 還原型谷胱甘肽 (GSH) 和氧化型谷胱甘肽(GSSG) 及谷胱甘肽還原酶 (GR) 活性測定

每隔6 d取樣，樣品 (5 g) 在液氮中研磨，然后加入磺基水楊酸，混合物在12 000×g下離心5 min，上清液用來測定GSH和GSSG的含量及谷胱甘肽還原酶活性；GSH和GSSG的測定均采用碧云天生物技術(shù)研究所 (江蘇海門) 的GSH和GSSG檢測試劑盒；谷胱甘肽還原酶 (GR) 活性根據(jù) Papanastasiou等的方法測定[12]。

所有實驗至少重復(fù)2次，每個水平5個重復(fù)，實驗結(jié)果以平均值附標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鍺對霍山石斛類原球莖增殖和多糖合成的影響

表1表示添加不同濃度的二氧化鍺時，霍山石斛類原球莖增殖和多糖積累情況，適當(dāng)濃度的二氧化鍺能夠促進(jìn)類原球莖增殖和多糖積累。當(dāng)二氧化鍺濃度為4.0 mg/L時，類原球莖的增殖速率最大，培養(yǎng)30 d時，細(xì)胞干重、細(xì)胞得率YC/S、多糖產(chǎn)量以及多糖得率 YP/S都最大，高濃度的鍺對類原球莖的增殖和多糖合成具有抑制作用，可能是高濃度的鍺對細(xì)胞具有毒害作用。

表1 鍺對霍山石斛類原球莖增殖和多糖合成的影響Table 1 Effects of germanium on the PLB proliferation and polysaccharide synthesis in suspension cultures of D. huoshanense

2.2 鍺對碳、氮吸收和利用的影響

在培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗主要用于細(xì)胞自身的增殖和產(chǎn)物的合成；培養(yǎng)基中主要的營養(yǎng)物質(zhì)是碳源和氮源。圖1A、B分別表示了鍺在最適濃度下，霍山石斛類原球莖培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中糖和硝酸鹽的消耗動態(tài)。

在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，碳源主要為蔗糖，其作用是提供細(xì)胞代謝過程中所需要的能量及細(xì)胞組分與代謝物的碳骨架。由圖1A可以看出，鍺對碳源的利用影響顯著 (P<0.05)，在4.0 mg/L二氧化鍺濃度下，類原球莖增殖速度快，糖的吸收快，糖的利用率也高，培養(yǎng)30 d時，培養(yǎng)基中的糖幾乎被耗盡；而不加二氧化鍺時，類原球莖對糖的吸收較慢，培養(yǎng)30 d時，培養(yǎng)基中的糖濃度為8 g/L左右。

氮源在培養(yǎng)基中的作用是合成蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞物質(zhì)，蛋白質(zhì)是細(xì)胞膜等結(jié)構(gòu)組分的重要成分。圖1B表示了培養(yǎng)基中硝酸鹽的吸收情況，鍺對氮源的利用影響顯著 (P<0.05)，添加4.0 mg/L二氧化鍺時，類原球莖吸收氮源的速度最快，且利用率也最高，而不加二氧化鍺時，類原球莖吸收氮源的速度最慢，利用率也最低。

2.3 鍺對胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖1 鍺對碳(A)、氮(B) 利用的影響Fig. 1 Effects of germanium on the utilization of sugars(A) and nitrate(B) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

胞內(nèi)還原性糖和蛋白質(zhì)的含量與細(xì)胞生理活性有一定的關(guān)系。細(xì)胞生長快，胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量高；胞內(nèi)可溶性還原糖在細(xì)胞的整個代謝中起著重要作用[13]，胞內(nèi)可溶性還原糖一方面提供細(xì)胞生長，另一方面用來合成多糖，胞內(nèi)可溶性還原糖含量高，細(xì)胞生長快，多糖積累也多。從圖2A、B可以看出，鍺對胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響顯著(P<0.05)，添加4.0 mg/L的二氧化鍺時，胞內(nèi)可溶性還原糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量均高于對照組，所以，鍺可以提高霍山石斛類原球莖的生理活性，促進(jìn)細(xì)胞生長及代謝產(chǎn)物的合成。

2.4 鍺對抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

超氧化物歧化酶是活性氧清除系統(tǒng)中重要抗氧化酶。由圖3A可知，用4.0 mg/L的二氧化鍺處理后，霍山石斛類原球莖細(xì)胞內(nèi)SOD活性明顯高于對照組 (P<0.05)。由圖 3B可以看出，鍺也能顯著提高CAT的活性 (P<0.05)，但對POD的活性 (圖3C)影響不大 (P>0.05)，甚至有抑制作用，可能是SOD和CAT活性的提高而抑制了POD的活性。

圖2 鍺對胞內(nèi)還原糖(A) 和蛋白質(zhì)(B) 含量的影響Fig. 2 Effects of germanium on the contents of intracellular reducing sugars(A), proteins(B) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

2.5 鍺對細(xì)胞氧化還原態(tài)和谷胱甘肽還原酶活性的影響

細(xì)胞內(nèi)GSH和GSSG的含量反映了細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。鍺誘導(dǎo)霍山石斛類原球莖細(xì)胞氧化還原態(tài)變化與對照組具有相似的變化趨勢。鍺對細(xì)胞氧化還原態(tài)和谷胱甘肽還原酶活性影響顯著(P<0.05)，處理組相對于對照組GSH的含量顯著提高 (圖 4A)，而 GSSG的含量顯著降低 (圖 4B)；GSH/GSSG值的變化見圖4C，鍺處理組一直高于對照組；谷胱甘肽還原酶(GR) 活性 (圖 4D) 分析表明，鍺處理組的GR活性明顯高于對照組。

3 討論

圖3 鍺對SOD(A)、CAT(B) 和POD(C) 活性的影響Fig. 3 The effects of germanium on the activities of SOD (A), CAT (B) and POD (C) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

霍山石斛類原球莖轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，細(xì)胞生長快慢和代謝水平與其生理狀態(tài)有關(guān)。在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，細(xì)胞活力與其繼代周期、繼代次數(shù)以及培養(yǎng)過程中細(xì)胞褐變有關(guān)[6]。碳和氮是植物細(xì)胞生長的主要營養(yǎng)成分，它們的吸收和利用直接影響細(xì)胞生長和產(chǎn)物合成。在霍山石斛類原球莖的懸浮培養(yǎng)過程中，多糖的合成不僅與細(xì)胞的生長有關(guān)，而且還與細(xì)胞內(nèi)的還原糖濃度有關(guān)[7]。培養(yǎng)基中的碳被吸收到細(xì)胞內(nèi)，一方面供應(yīng)細(xì)胞生長，另一方面用來合成多糖。蛋白質(zhì)是植物生長發(fā)育的物質(zhì)基礎(chǔ)，適當(dāng)濃度的鍺處理植物細(xì)胞可以加快蛋白質(zhì)的合成，從而為類原球莖的增殖分化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。添加適當(dāng)濃度的二氧化鍺可以提高細(xì)胞的生理活性，促進(jìn)碳氮的吸收和利用，從而促進(jìn)類原球莖的增殖和多糖的合成。

圖4 鍺對細(xì)胞內(nèi)GSH(A)、GSSG(B)、GSH/GSSG(C) 和谷胱甘肽還原酶活性(D) 的影響Fig.4 The effects of germanium on the contents of GSH(A), GSSG(B), GSH/GSSG(C) and activity of glutathione reductase(D) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

植物在生長過程中會產(chǎn)生很多活性氧和自由基，它們參與重要的生理生化反應(yīng)，然而高濃度的活性氧和自由基對細(xì)胞有毒害作用，引起細(xì)胞褐變而死亡。植物體內(nèi)有活性氧和自由基清除系統(tǒng)SOD、CAT和POD等酶，這些酶協(xié)調(diào)作用，使活性氧和自由基的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)?；羯绞愒蚯o在培養(yǎng)過程中經(jīng)常會發(fā)生褐變而抑制細(xì)胞生長。與對照相比，適當(dāng)濃度的二氧化鍺可以提高霍山石斛類原球莖細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT的活性，降低細(xì)胞褐變，提高了類原球莖細(xì)胞的生理活性，促進(jìn)類原球莖的增殖和多糖的合成。

細(xì)胞中谷胱甘肽氧化還原態(tài)的水平對細(xì)胞生長和代謝物的合成具有重要影響[14]。Papanastaiou等發(fā)現(xiàn)，在咖啡愈傷組織培養(yǎng)過程中谷胱甘肽氧化還原態(tài)的變化影響愈傷組織的增殖和體細(xì)胞胚胎的發(fā)生發(fā)育[12]。Belmonte等在研究云杉體胚發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn) GSH 含量的提高促進(jìn)體胚發(fā)育[15]。另外，GSH/GSSG的值與基因表達(dá)有關(guān)[16]。本研究顯示，適當(dāng)濃度的鍺能夠提高谷胱甘肽還原酶的活性，細(xì)胞內(nèi)GSH的含量高于對照組，在培養(yǎng)12 d時，GSH含量達(dá)到最高值，是同期對照組的 1.5倍；GSH/GSSG的比值在培養(yǎng)的第6天迅速提高，在培養(yǎng)的12 d至24 d始終保持較高的比值，是對照組的2.2倍，與之相對應(yīng)類原球莖增殖量和多糖積累量都高于對照組，實驗結(jié)果表明，適量的鍺改變了細(xì)胞的氧化還原態(tài)，而氧化還原態(tài)的變化可以促進(jìn)細(xì)胞生長和多糖合成。

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