鍺對霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)細胞生長和多糖合成及氧化還原態(tài)的影響

魏明，楊超英，姜紹通

1 安徽工程科技學院生化系，蕪湖 241000

2 合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，合肥 230009

霍山石斛 (Dendrobium huoshanense C.Z.J.cheng)屬于蘭科石斛屬，是名貴中草藥，產(chǎn)于安徽霍山及臨近地區(qū)，具有滋陰、清熱、生津、潤肺、止咳、清音明目等功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，石斛多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫功能[2]、抗白內(nèi)障活性[3]。由于霍山石斛自然繁殖能力很低，在自然條件下生長緩慢、生長周期長，加上人工大量采集，其自然資源已瀕臨滅絕。類原球莖是霍山石斛離體繁殖過程的中間形態(tài)，可由植株的不同部位誘導產(chǎn)生，具有和植株同樣的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能[4]，類原球莖本身可以增殖。由于霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)周期較長，在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物常常發(fā)生褐變，導致細胞生長緩慢。提高霍山石斛類原球莖的細胞活力，加快其增殖是實現(xiàn)霍山石斛類原球莖大規(guī)模培養(yǎng)的基礎。

鍺可以調(diào)節(jié)植物的生長，保護細胞膜不受損傷，提高細胞的抗氧化能力[5]。通過研究二氧鍺對霍山石斛類原球莖懸浮培養(yǎng)細胞生長和多糖合成的影響，分析細胞中還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD、CAT和POD等酶的活性變化以及細胞的氧化還原態(tài)變化與細胞生長、產(chǎn)物合成的關系，為解決霍山石斛類原球莖增殖緩慢問題奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

霍山石斛類原球莖由本實驗室誘導保存，在無激素固體MS培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，繼代周期為30 d，生長培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，其中微量元素、有機元素減半，大量元素：KNO330 mmol/L、KH2PO41.25 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.5 mmol/L和CaCl2·2H2O 4.5 mmol/L，蔗糖濃度為3%。

1.2 類原球莖懸浮培養(yǎng)條件

依據(jù)文獻[6]和[7]，取生長30 d的類原球莖接種于裝有60 mL液體培養(yǎng)基 (pH為5.8) 的250 mL三角瓶中，接種量為100 g (鮮重)/L；分別添加終濃度為0、1.0、3.0、4.0、5.0、7.0、10.0 mg/L的二氧化鍺，置于搖床上 (110 r/min)，25℃±2℃下懸浮培養(yǎng)，光照周期為14 h/d，日光燈光強為40 μmol/m2·s。

1.3 細胞生長量和多糖測定

每隔6 d隨機取樣1次，用蒸餾水洗2次，再用濾紙吸干類原球莖表面的水分后稱重為濕重，把類原球莖置于60℃烘箱中烘至恒重為干重。提取多糖前，類原球莖先用蒸餾水洗2次，然后研碎用蒸餾水在 50℃~60℃水浴中提取 3次，收集水提液，加95%乙醇至乙醇濃度為80%過夜沉淀，最后收集沉淀。沉淀溶于蒸餾水中用savage法脫蛋白，并用苯酚-硫酸測定多糖[8](采用723分光光度計測定)。培養(yǎng)基中的多糖提取方法同上，總多糖為胞內(nèi)和胞外多糖之和。

類原球莖生物量=收獲類原球莖的總干重/接種時培養(yǎng)基體積 (g/L)；類原球莖的比生長速率(X為生物量，t為培養(yǎng)時間，dX/dt為類原球莖增殖速率)；多糖總產(chǎn)量=多糖總提取量/接種時培養(yǎng)基體積 (g/L)；細胞得率 YC/S=細胞增殖量 (干重)/蔗糖消耗量；多糖得率 YP/S=多糖增加量/蔗糖消耗量。

1.4 培養(yǎng)基中殘?zhí)?、硝酸鹽、細胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)測定

培養(yǎng)基中的殘?zhí)怯帽椒?硫酸法測定[8]，硝酸根離子用水楊酸-濃硫酸法測定[9](考慮到培養(yǎng)過程中水分的蒸發(fā)對測定的影響，在測定培養(yǎng)基中的各種成分時，保持培養(yǎng)基的體積為接種時的體積)?？扇苄赃€原糖用還原糖法測定[10]，可溶性蛋白質(zhì)用Bradford法測定[11]。

1.5 抗氧化酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD) 的活性采用 SOD試劑盒測定，單位 U/g；過氧化氫酶(CAT) 的活性采用CAT試劑盒測定，單位U/g；SOD和CAT試劑盒由南京建成生物研究所提供。過氧化物酶(POD) 活性以愈創(chuàng)木酚法測定：取5 g類原球莖(鮮重) 在冰浴中研碎，然后加0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液 (pH 6.8)提取粗酶液。反應總體積為 3 mL，其中底物為0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚1.0 mL，H2O2(2%) 1.0 mL，粗酶液0.1 mL，pH 6.8磷酸鹽緩沖液0.9 mL，在470 nm下測定吸光值的變化。酶活力定義為：以每分鐘每克鮮重吸光度的變化0.01為一個酶活單位 (U/g)。

1.6 還原型谷胱甘肽 (GSH) 和氧化型谷胱甘肽(GSSG) 及谷胱甘肽還原酶 (GR) 活性測定

每隔6 d取樣，樣品 (5 g) 在液氮中研磨，然后加入磺基水楊酸，混合物在12 000×g下離心5 min，上清液用來測定GSH和GSSG的含量及谷胱甘肽還原酶活性；GSH和GSSG的測定均采用碧云天生物技術(shù)研究所 (江蘇海門) 的GSH和GSSG檢測試劑盒；谷胱甘肽還原酶 (GR) 活性根據(jù) Papanastasiou等的方法測定[12]。

所有實驗至少重復2次，每個水平5個重復，實驗結(jié)果以平均值附標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鍺對霍山石斛類原球莖增殖和多糖合成的影響

表1表示添加不同濃度的二氧化鍺時，霍山石斛類原球莖增殖和多糖積累情況，適當濃度的二氧化鍺能夠促進類原球莖增殖和多糖積累。當二氧化鍺濃度為4.0 mg/L時，類原球莖的增殖速率最大，培養(yǎng)30 d時，細胞干重、細胞得率YC/S、多糖產(chǎn)量以及多糖得率 YP/S都最大，高濃度的鍺對類原球莖的增殖和多糖合成具有抑制作用，可能是高濃度的鍺對細胞具有毒害作用。

表1 鍺對霍山石斛類原球莖增殖和多糖合成的影響Table 1 Effects of germanium on the PLB proliferation and polysaccharide synthesis in suspension cultures of D. huoshanense

2.2 鍺對碳、氮吸收和利用的影響

在培養(yǎng)過程中，營養(yǎng)物質(zhì)的消耗主要用于細胞自身的增殖和產(chǎn)物的合成；培養(yǎng)基中主要的營養(yǎng)物質(zhì)是碳源和氮源。圖1A、B分別表示了鍺在最適濃度下，霍山石斛類原球莖培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基中糖和硝酸鹽的消耗動態(tài)。

在植物細胞培養(yǎng)過程中，碳源主要為蔗糖，其作用是提供細胞代謝過程中所需要的能量及細胞組分與代謝物的碳骨架。由圖1A可以看出，鍺對碳源的利用影響顯著 (P<0.05)，在4.0 mg/L二氧化鍺濃度下，類原球莖增殖速度快，糖的吸收快，糖的利用率也高，培養(yǎng)30 d時，培養(yǎng)基中的糖幾乎被耗盡；而不加二氧化鍺時，類原球莖對糖的吸收較慢，培養(yǎng)30 d時，培養(yǎng)基中的糖濃度為8 g/L左右。

氮源在培養(yǎng)基中的作用是合成蛋白質(zhì)和核酸等細胞物質(zhì)，蛋白質(zhì)是細胞膜等結(jié)構(gòu)組分的重要成分。圖1B表示了培養(yǎng)基中硝酸鹽的吸收情況，鍺對氮源的利用影響顯著 (P<0.05)，添加4.0 mg/L二氧化鍺時，類原球莖吸收氮源的速度最快，且利用率也最高，而不加二氧化鍺時，類原球莖吸收氮源的速度最慢，利用率也最低。

2.3 鍺對胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

圖1 鍺對碳(A)、氮(B) 利用的影響Fig. 1 Effects of germanium on the utilization of sugars(A) and nitrate(B) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

胞內(nèi)還原性糖和蛋白質(zhì)的含量與細胞生理活性有一定的關系。細胞生長快，胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量高；胞內(nèi)可溶性還原糖在細胞的整個代謝中起著重要作用[13]，胞內(nèi)可溶性還原糖一方面提供細胞生長，另一方面用來合成多糖，胞內(nèi)可溶性還原糖含量高，細胞生長快，多糖積累也多。從圖2A、B可以看出，鍺對胞內(nèi)還原糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響顯著(P<0.05)，添加4.0 mg/L的二氧化鍺時，胞內(nèi)可溶性還原糖、可溶性蛋白質(zhì)的含量均高于對照組，所以，鍺可以提高霍山石斛類原球莖的生理活性，促進細胞生長及代謝產(chǎn)物的合成。

2.4 鍺對抗氧化酶系統(tǒng)活性的影響

超氧化物歧化酶是活性氧清除系統(tǒng)中重要抗氧化酶。由圖3A可知，用4.0 mg/L的二氧化鍺處理后，霍山石斛類原球莖細胞內(nèi)SOD活性明顯高于對照組 (P<0.05)。由圖 3B可以看出，鍺也能顯著提高CAT的活性 (P<0.05)，但對POD的活性 (圖3C)影響不大 (P>0.05)，甚至有抑制作用，可能是SOD和CAT活性的提高而抑制了POD的活性。

圖2 鍺對胞內(nèi)還原糖(A) 和蛋白質(zhì)(B) 含量的影響Fig. 2 Effects of germanium on the contents of intracellular reducing sugars(A), proteins(B) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

2.5 鍺對細胞氧化還原態(tài)和谷胱甘肽還原酶活性的影響

細胞內(nèi)GSH和GSSG的含量反映了細胞的氧化還原狀態(tài)。鍺誘導霍山石斛類原球莖細胞氧化還原態(tài)變化與對照組具有相似的變化趨勢。鍺對細胞氧化還原態(tài)和谷胱甘肽還原酶活性影響顯著(P<0.05)，處理組相對于對照組GSH的含量顯著提高 (圖 4A)，而 GSSG的含量顯著降低 (圖 4B)；GSH/GSSG值的變化見圖4C，鍺處理組一直高于對照組；谷胱甘肽還原酶(GR) 活性 (圖 4D) 分析表明，鍺處理組的GR活性明顯高于對照組。

3 討論

圖3 鍺對SOD(A)、CAT(B) 和POD(C) 活性的影響Fig. 3 The effects of germanium on the activities of SOD (A), CAT (B) and POD (C) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

霍山石斛類原球莖轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，細胞生長快慢和代謝水平與其生理狀態(tài)有關。在植物細胞培養(yǎng)過程中，細胞活力與其繼代周期、繼代次數(shù)以及培養(yǎng)過程中細胞褐變有關[6]。碳和氮是植物細胞生長的主要營養(yǎng)成分，它們的吸收和利用直接影響細胞生長和產(chǎn)物合成。在霍山石斛類原球莖的懸浮培養(yǎng)過程中，多糖的合成不僅與細胞的生長有關，而且還與細胞內(nèi)的還原糖濃度有關[7]。培養(yǎng)基中的碳被吸收到細胞內(nèi)，一方面供應細胞生長，另一方面用來合成多糖。蛋白質(zhì)是植物生長發(fā)育的物質(zhì)基礎，適當濃度的鍺處理植物細胞可以加快蛋白質(zhì)的合成，從而為類原球莖的增殖分化提供了物質(zhì)基礎。添加適當濃度的二氧化鍺可以提高細胞的生理活性，促進碳氮的吸收和利用，從而促進類原球莖的增殖和多糖的合成。

圖4 鍺對細胞內(nèi)GSH(A)、GSSG(B)、GSH/GSSG(C) 和谷胱甘肽還原酶活性(D) 的影響Fig.4 The effects of germanium on the contents of GSH(A), GSSG(B), GSH/GSSG(C) and activity of glutathione reductase(D) in suspension cultures of PLBs of D. huoshanense.

植物在生長過程中會產(chǎn)生很多活性氧和自由基，它們參與重要的生理生化反應，然而高濃度的活性氧和自由基對細胞有毒害作用，引起細胞褐變而死亡。植物體內(nèi)有活性氧和自由基清除系統(tǒng)SOD、CAT和POD等酶，這些酶協(xié)調(diào)作用，使活性氧和自由基的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)?；羯绞愒蚯o在培養(yǎng)過程中經(jīng)常會發(fā)生褐變而抑制細胞生長。與對照相比，適當濃度的二氧化鍺可以提高霍山石斛類原球莖細胞內(nèi)SOD和CAT的活性，降低細胞褐變，提高了類原球莖細胞的生理活性，促進類原球莖的增殖和多糖的合成。

細胞中谷胱甘肽氧化還原態(tài)的水平對細胞生長和代謝物的合成具有重要影響[14]。Papanastaiou等發(fā)現(xiàn)，在咖啡愈傷組織培養(yǎng)過程中谷胱甘肽氧化還原態(tài)的變化影響愈傷組織的增殖和體細胞胚胎的發(fā)生發(fā)育[12]。Belmonte等在研究云杉體胚發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn) GSH 含量的提高促進體胚發(fā)育[15]。另外，GSH/GSSG的值與基因表達有關[16]。本研究顯示，適當濃度的鍺能夠提高谷胱甘肽還原酶的活性，細胞內(nèi)GSH的含量高于對照組，在培養(yǎng)12 d時，GSH含量達到最高值，是同期對照組的 1.5倍；GSH/GSSG的比值在培養(yǎng)的第6天迅速提高，在培養(yǎng)的12 d至24 d始終保持較高的比值，是對照組的2.2倍，與之相對應類原球莖增殖量和多糖積累量都高于對照組，實驗結(jié)果表明，適量的鍺改變了細胞的氧化還原態(tài)，而氧化還原態(tài)的變化可以促進細胞生長和多糖合成。

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