表達ApxIA的血清7型胸膜肺炎放線桿菌弱毒菌株的構(gòu)建及特性分析

劉金林，陳硯，胡琳琳，貝為成，陳煥春

1 華中農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

2 華中師范大學生命科學學院，武漢 430079

胸 膜 肺 炎 放 線 桿 菌 (Actinobacillus pleuropneumoniae，APP) 為革蘭氏陰性桿菌，目前該菌共有15個血清型[1]，除血清13和14型細菌生長為不依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD) 的生物Ⅱ型外，其余13種血清型菌均為依賴NAD生長的生物I型，并都與豬致病相關(guān)。APP可引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia，PCP)，在世界各國均有發(fā)生，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[2]?？股卦陬A(yù)防和控制細菌性傳染病上曾起到很大作用，但隨著耐藥菌株的頻繁出現(xiàn)以及國家對抗生素使用的嚴格限制，疫苗將成為控制豬傳染性胸膜肺炎的主要手段。目前所使用的疫苗主要是全細菌滅活疫苗或亞單位疫苗。由于APP血清型多，各血清型之間交叉保護率較低，大大增加了防治該病的難度[3]。近年來，胸膜肺炎放線桿菌減毒活疫苗的研究，為該病的防治帶來新希望[4-6]?？梢灶A(yù)見，應(yīng)用新型安全、高效的基因缺失疫苗將成為控制豬傳染性胸膜肺炎的一種趨勢。由于血清 7型胸膜肺炎放線桿菌不分泌毒素 ApxI僅分泌毒素 ApxII，而毒素 ApxI和毒素ApxII既是APP兩個主要的毒力因子，同時又是作為APP兩個關(guān)鍵的免疫保護性蛋白，因此，擬通過本研究探索提高胸膜肺炎放線桿菌弱毒疫苗免疫原性的途徑，同時可以通過該系統(tǒng)表達其他呼吸系統(tǒng)病原的重要免疫原，為呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防與控制提供新方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+) 購自美國Sigma公司。各種限制性內(nèi)切酶、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker、pMD18-T載體購自大連寶生物工程(大連) 有限公司。DNA凝膠回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。胰蛋白大豆瓊脂 (Tryptic soy agar，TSA)、胰蛋白大豆肉湯 (Tryptic soy broth，TSB) 購自美國Difco公司。

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

胸膜肺炎放線桿菌血清7型apxIIC-基因缺失弱毒疫苗菌株HB04C-由本實驗室貝為成博士構(gòu)建并保存[7]。血清1型胸膜肺炎放線桿菌SLW01為本實驗室分離并保存。大腸桿菌Escherichia coli DH5α由本實驗室保存。穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN由瑞士伯尼爾大學Joachim Frey教授惠贈[8]。

1.1.3 引物

引物設(shè)計見表1。

1.1.4 實驗動物

6~8周齡仔豬購自湖北省某大型豬場，胸膜肺炎放線桿菌血清學和病原學檢測均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 APP基因組制備及apxIA基因擴增

取血清1型APP分離株SLW01的新鮮培養(yǎng)物，根據(jù)文獻[10]描述的方法提取APP基因組。以基因組為模板，通過引物P1和P2為擴增到apxIA基因。擴增條件為：94 ℃ 5 min ；94 ℃ 1 min ，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，共30個循環(huán)；然后72℃延伸10 min。

表1 本研究所用引物及說明Table 1 Primers used in this study

1.2.2 穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將前述PCR產(chǎn)物apxIA基因連接到pMD18-T載體，得到質(zhì)粒pMD-apxIA，經(jīng)酶切鑒定正確后，以Pst I/Not I雙酶切，回收apxIA片段并連接到經(jīng)同樣酶切的穿梭質(zhì)粒 pJFF224-XN中，得到攜帶外源基因的穿梭質(zhì)粒pJFF-IA。

1.2.3 突變株的篩選

大量制備質(zhì)粒pJFF-IA，以電轉(zhuǎn)化將重組穿梭質(zhì)粒pJFF-IA轉(zhuǎn)化胸膜肺炎放線桿菌弱毒株HB04C-。胸膜肺炎放線桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備以及電轉(zhuǎn)化條件參考文獻[7]進行。經(jīng)過氯霉素抗性篩選，得到氯霉素抗性的菌株，再以PCR (引物P3/P4) 加以驗證。將得到的突變株命名為 HB04C2 (apxIIC?/ apxIIA+/apxIA+)。

1.2.4 HB04C2的遺傳穩(wěn)定性分析

將得到的重組菌HB04C2分別在含有氯霉素抗性的TSA培養(yǎng)基和不含抗性的TSA培養(yǎng)基上傳20代，每代細菌均取樣，用引物P3/P4 PCR鑒定，以確定HB04C2的遺傳穩(wěn)定性。

1.2.5 HB04C2分泌性外毒素的檢測

首先提取親本菌和重組菌株天然毒素[11]，然后以本實驗室制備的抗ApxIA的單克隆抗體為一抗，進行Western blotting檢測[12]。

1.2.6 HB04C2的增殖能力分析

將過夜培養(yǎng)的HB04C-和HB04C2分別以1:1000比例接種到100 mL TSB培養(yǎng)基 (含NAD和10%小牛血清)，接種后每隔1 h取樣，測定菌液在600 nm下的吸光值，共計10 h，重復(fù)3次取平均值。比較2個菌株的增長能力。

1.2.7 HB04C2對仔豬的免疫保護性研究

選取10頭健康仔豬 (6~8周齡，APP病原學血清學均為陰性)，隨機分為2組，每組5頭。將HB04C2 (活菌含量1×108CFU) 通過氣管接種免疫第一組仔豬，間隔2周，以同樣方式加強免疫，第二組仔豬接種TSB作為陰性對照。在一免前、二免前以及攻毒前通過前腔靜脈采血，用本實驗室建立的ApxI-ELISA、ApxII-ELISA檢測方法檢測毒素ApxIA、ApxIIA抗體[13-14]。第2次免疫2周后，連同TSB對照，用血清1型APP分離菌株SLW01 (活菌含量1×108CFU)通過氣管注射對仔豬進行攻毒，觀察攻毒后仔豬的狀態(tài)，并于7 d后將存活豬處死觀察剖檢病變。仔豬臨床癥狀指數(shù) (Clinical sign score) 的評定參考Tumamao等[15]描述的標準：0=無癥狀；1=呼吸頻率增加；2=腹式呼吸；3=咳嗽；4=呼吸困難；5=死亡。按照Hannan等[16]描述的方法評價仔豬肺部損傷情況：即將整個肺分成7個部分，按肺部病變程度給每部分評分，每部分的最高分為5分，損傷越大，分值越高，各部分分數(shù)之和作為肺部損傷指數(shù) (Lung lesion score)。

2 結(jié)果

2.1 穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的構(gòu)建

PCR擴增的apxIA基因產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體中，序列分析證實無堿基誤配。經(jīng)Pst I和Not I酶切apxIA并插入到穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN的T4啟動子下游。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)Pst I和Not I雙酶切后得到2條約為7000 bp和3000 bp的片段，表明質(zhì)粒構(gòu)建正確 (圖1)。

2.2 穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的電轉(zhuǎn)化及HB04C2的篩選

通過高效電穿孔方法將穿梭質(zhì)粒pJFF-IA轉(zhuǎn)化到HB04C-。通過氯霉素抗性篩選，得到陽性克隆，以apxIA N端特異性引物P3和P4進行PCR擴增，可得到826 bp特異片段，而親本菌HB04C-為陰性(圖略)。

圖1 重組質(zhì)粒pJFF-IA的酶切鑒定Fig. 1 Identification of pJFF-IA by enzyme digestion. M: DNA ladder 15 000; 1: pJFF-IA digested with Not I/Pst I.

2.3 HB04C2的生物學特性

HB04C2在含氯霉素培養(yǎng)基和不含氯霉素培養(yǎng)基連續(xù)傳代后，都能擴增出apxIA N端826 bp特異片段 (圖略)，表明穿梭質(zhì)粒pJFF-IA在APP菌株HB04C2中能夠穩(wěn)定傳代。提取重組菌HB04C2和親本菌HB04C-的分泌性蛋白，用抗ApxIA單克隆抗體作為一抗進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示重組菌HB04C2在110 kDa處出現(xiàn)一條特異性帶，與預(yù)期的分子量相當 (圖2)，但同時發(fā)現(xiàn)另有一條略小的雜交帶，筆者推測其可能是apxIA從469~3069 bp的表達產(chǎn)物 (大小約為93.8 kDa)。而親本菌株HB04C-未出現(xiàn)該特異性帶，結(jié)果表明穩(wěn)定攜帶穿梭質(zhì)粒pJFF-IA的基因工程重組菌株HB04C2能夠表達且分泌具有免疫學活性的ApxIA。重組菌HB04C2和親本菌HB04C-的生長曲線如圖3所示?？梢娭亟M菌和親本菌生長能力差別不大，表明攜帶穿梭質(zhì)粒并沒有明顯影響APP的生長速度。

圖2 SDS-PAGE (A) 和Western blotting (B) 檢測重組菌株ApxIA的表達Fig. 2 Detection of ApxIA secreted by HB04C2. (A) SDS-PAGE. (B) Western blotting. 1: HB04C2; 2: HB04C-.

圖3 HB04C2體外增殖能力分析Fig. 3 Growth ability of attenuated A. pleuropneumoniae strains in vitro.

2.4 HB04C2的免疫原性研究

2.4.1 免疫仔豬血清學檢測

結(jié)果顯示，經(jīng)氣管接種HB04C2后，在14 d可以檢測到ApxIA和ApxIIA的抗體，到首免后28 d，抗體提高很多 (圖 4)，與對照組比較差異均極顯著(P<0.01)，對照組的仔豬在整個試驗過程血清抗體均呈陰性。

2.4.2 攻毒保護效果

對照組仔豬在攻毒后表現(xiàn)出厭食、喘氣、呼吸極度困難，有的口吐白沫等傳染性胸膜肺炎臨床癥狀，攻毒后24 h內(nèi)全部死亡，解剖后可見肺部嚴重出血。氣管免疫組仔豬在攻毒后，當天表現(xiàn)嗜睡、喘氣，但攻毒2 d后基本恢復(fù)正常；解剖只有1頭仔豬肺局部有出血點，其余4頭正常。免疫組的肺損傷指數(shù)顯著低于對照組 (P<0.01) (表 2)。結(jié)果表明，HB04C2能提供給仔豬對異源血清1型APP攻擊的有效保護。

圖4 仔豬血清抗體檢測Fig. 4 Evaluation of antibodies against ApxIA (A) and ApxIIA (B). * P < 0.01 compared with the TSB group.

表2 HB04C2免疫動物的攻毒保護結(jié)果Table 2 Protection of pigs against challenge with heterologous virulent A. pleuropneumoniae serovar 1

3 討論

胸膜肺炎放線桿菌是豬傳染性胸膜肺炎的致病菌，該病是一種急性或慢性呼吸道疾病，以肺部出血性、纖維素性和壞死性肺炎為特征，具有高度的傳染性，各種年齡的豬均可感染發(fā)病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。疫苗免疫可預(yù)防APP的感染，而弱毒疫苗則以其高效和可誘導(dǎo)交叉保護的特點吸引著諸多研究者的目光。隨著分子生物學發(fā)展及APP分子致病機理研究的深入，利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)和基因工程方法，通過失活毒力相關(guān)因子，構(gòu)建低毒力甚至無毒力APP基因工程弱毒活疫苗菌株，成為目前豬傳染性胸膜肺炎疫苗研究的熱點領(lǐng)域。

APP共有4種RTX毒素，分別為ApxI、ApxII、ApxIII和ApxIV。其中ApxI有強的溶血活性和強細胞毒性，ApxII的溶血活性和細胞毒性都相對較弱，ApxIII無溶血活性，但有強的細胞毒性[17]。除ApxIV在所有血清型APP都存在外，每種血清型APP最多只含ApxI、ApxII、ApxIII中的兩種[17-18]。同時含有ApxI和ApxII的菌株表現(xiàn)為高致病性。本研究選用本實驗室構(gòu)建的apxIIC基因缺失菌株HB04C-為親本菌株，是因為先前已對該基因缺失菌株的安全性、免疫原性和誘導(dǎo)動物的免疫保護率都有了全面的研究[7,19]。該弱毒菌株免疫動物能完全抵抗同源血清7型APP的攻擊，但對毒力最強的異源血清1型APP的保護率只有70%，因為該弱毒菌株不能產(chǎn)生重要的保護性抗原ApxIA。為了提高HB04C-對異源血清1型APP的保護率，增強該菌株的免疫效力，本研究使用穿梭質(zhì)粒，可以在 HB04C-中穩(wěn)定表達ApxIA，且血清7型APP中含有apxIB/apxID基因，可以為ApxIA的分泌提供通道[17]。作為APP重要的免疫原，單獨免疫ApxIA天然毒素或原核表達產(chǎn)物[20]，或 ApxIA的部分片段[21]，或是某些抗原表位[22]，均可產(chǎn)生較好的保護效果。經(jīng)氣管免疫HB04C2后，可誘導(dǎo)仔豬產(chǎn)生針對ApxIA的抗體，表明重組菌株產(chǎn)生的ApxIA具有良好的免疫原性，經(jīng)過加強免疫后，ApxIA抗體水平顯著提高，表明該表達系統(tǒng)具有較高的表達活性，外源基因的表達產(chǎn)物可刺激動物產(chǎn)生顯著的免疫應(yīng)答反應(yīng)。以強毒血清1型APP攻擊后，空白對照組表現(xiàn)嚴重的胸膜肺炎癥狀并死亡，免疫組仔豬表現(xiàn)為輕微或中等程度的臨床癥狀，但于觀察期內(nèi)恢復(fù)正常，重組菌株對致死性劑量的強毒菌株的攻擊提供了完全保護，表明該菌株具有較好的交叉保護能力。

本實驗中免疫方式為氣管注射免疫，其操作難度較大，易對仔豬造成應(yīng)激，而且在注射部位及周邊組織會水腫等問題。本實驗室曾嘗試采用滴鼻免疫，可以達到較好的免疫效果[23]。有資料顯示，可通過密閉的氣霧發(fā)生裝置，讓動物吸入攜帶APP的氣溶膠來進行接種，能達到較好的感染效果[24]。因此，對于弱毒疫苗在規(guī)?；B(yǎng)殖場中的推廣應(yīng)用，采用氣霧免疫或滴鼻免疫的方式可能會更加適用，但這些方法的廣泛應(yīng)用，還需要一段時間的探索。

雖然穿梭質(zhì)粒本身攜帶的抗生素抗性基因產(chǎn)生的食品安全隱患，有待進一步改善，如構(gòu)建無抗生素基因的平衡致死系統(tǒng)。ApxIA的血清7型APP菌株的構(gòu)建及特性分析，為今后開發(fā)以APP弱毒菌株為載體的呼吸系統(tǒng)疾病的新型多價疫苗以及研究APP的基因功能奠定了基礎(chǔ)。

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