乙胺嘧啶分子印跡聚合物的制備及其性能研究*

劉發(fā)強(qiáng)，遲大民，蘇立強(qiáng)，王 穎

（齊齊哈爾大學(xué) 化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

分子印跡技術(shù)是近年來(lái)集高分子合成、分子設(shè)計(jì)、分子識(shí)別、仿生生物工程等眾多學(xué)科優(yōu)勢(shì)發(fā)展起來(lái)的一門邊緣學(xué)科分支。分子印跡聚合物由于具有與天然抗體相似的識(shí)別選擇性和高分子材料的抗腐蝕性能的雙重優(yōu)點(diǎn)，因而正逐步應(yīng)用于分析化學(xué)、生物工程、臨床醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品工業(yè)等眾多領(lǐng)域。在固相提取、藥物的手性分離[1]、傳感器等方面展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景。

乙胺嘧啶[2]是一種廣譜抗菌獸藥，主要用于防治雞球蟲病、禽霍亂及仔豬白痢等。乙胺嘧啶在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上也有著廣泛的應(yīng)用，適量使用能增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的抗病能力，但是乙胺嘧啶在水產(chǎn)品體內(nèi)具有高度的蓄積性，超出一定范圍，人食用后破壞人的造血系統(tǒng)，造成溶血性貧血癥，甚至有引起潛在致癌性的可能，同時(shí)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有直接的毒性作用。敵菌凈屬于二氨基嘧啶類藥物，是一種抗菌增效劑，主要與乙胺嘧啶和磺胺類藥物等抗生素組成復(fù)方制劑，抗菌活性增強(qiáng)，在獸醫(yī)臨床上應(yīng)用十分廣泛。因此，在動(dòng)物產(chǎn)品和水產(chǎn)品體內(nèi)會(huì)同時(shí)殘留乙胺嘧啶和敵菌凈[3]，針對(duì)乙胺嘧啶有致癌的可能性和對(duì)神經(jīng)中樞的毒害作用將乙胺嘧啶與敵菌凈進(jìn)行分離是十分重要的[4]。

本文采用分子印跡技術(shù)，以乙胺嘧啶為模板分子，甲基丙烯酸（MAA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，在苯甲醇和乙腈的混合溶液中制備了乙胺嘧啶分子印跡聚合物。把制得的乙胺嘧啶分子印跡聚合物用于液相色譜固定相，在甲醇水為流動(dòng)相中可將其與結(jié)構(gòu)類似物敵菌凈基線分離，吸附實(shí)驗(yàn)中印跡聚合物對(duì)乙胺嘧啶有特異的吸附性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（UV230+紫外可變波長(zhǎng)檢測(cè)器，P230高壓恒流泵）；Echrom2000色譜工作站（大連依利特分析儀器有限公司）；TU-1901型雙波長(zhǎng)紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（北京泰克儀器有限公司）。

乙胺嘧啶和敵菌凈（純度＞98%，武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（A.R.東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；偶氮二異丁睛（A.R.北京化工廠）；甲基丙烯酸（A.R.北京化工廠）。

1.2 聚合物的制備

稱取模板分子乙胺嘧啶0.2487g（1mmol），將其溶于10mL苯甲醇和5mL乙腈混合溶液中，再加入功能單體甲基丙烯酸0.35g（4mmol），加入交聯(lián)劑EDMA 4.0g（20mmol），引發(fā)劑 AIBN 0.05g，超聲震蕩后將其轉(zhuǎn)入安培管中，反復(fù)抽真空脫氧，充N23～5次，最后在N2保護(hù)下抽真空封管。采用熱引發(fā)方式聚合，將安培管放入60℃恒溫水浴中，反應(yīng)48h后取出，將得到的聚合物經(jīng)過粗研，用索式提取器提取24h，提取液為苯甲醇/乙酸體積比為9∶1，以除去模板分子。將洗脫完的聚合物過300目分樣篩，用丙酮反復(fù)沉降，移出清液，把剩余固體放在通風(fēng)櫥內(nèi)自然晾干，以備使用。

制備非印跡聚合物NMIP時(shí)，除不加模板分子和無(wú)需進(jìn)行索氏提取以外，其它步驟同上。

1.3 色譜條件

色譜柱：20 cm×4.6 mm i d；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；流速為1.0 mL·min-1；流動(dòng)相為甲醇：水（0.6%冰乙酸）=25:75；進(jìn)樣量 10μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制一系列濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg·mL-1的乙胺嘧啶甲醇溶液，用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)。繪制乙胺嘧啶濃度與色譜峰面積值的工作曲線如圖1，回歸方程式為y=363.69x+33.702，線性相關(guān)系數(shù)0.9996。由圖1可見，乙胺嘧啶濃度在0.1～0.9 mg·mL-1范圍內(nèi)，兩者之間有良好的線性關(guān)系。

圖1 乙胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of pyrimethamine

2.2 MIP對(duì)乙胺嘧啶的吸附作用及選擇性研究

采用靜態(tài)吸附法考察所制備的MIPs吸附性能。配制一系列濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg·mL-1的乙胺嘧啶甲醇溶液各 10 mL，分別投入50mg乙胺嘧啶分子印跡聚合物，靜置過夜。用高效液相色譜測(cè)量其峰面積A，依據(jù)工作曲線計(jì)算出不同峰面積所對(duì)應(yīng)底物的平衡濃度。

根據(jù)結(jié)合前后溶液中底物濃度的變化，由方程Q=（Co-Ce）V/W計(jì)算出聚合物對(duì)底物的吸附量Q（mg·g-1），繪出吸附量Q與不同濃度關(guān)系的動(dòng)力學(xué)曲線。其中：Co：乙胺嘧啶溶液的初始濃度；Ce：吸附后的濃度；V：加入乙胺嘧啶溶液的體積；W：稱取的分子印跡聚合物的質(zhì)量。

圖2 MIP和NMIP的吸附量Fig.2 Adsorbance of MIP and NMIP

由圖2可以看出，印跡聚合物對(duì)乙胺嘧啶具有特異性吸附。對(duì)比二種聚合物的合成過程，可以得出印跡聚合物對(duì)乙胺嘧啶具有特異性吸附的原因是，在合成過程中由于乙胺嘧啶的加入而形成了復(fù)合物，當(dāng)洗滌出模板物質(zhì)后在聚合物內(nèi)部形成了形狀與官能團(tuán)位置均與乙胺嘧啶相配合的空腔，正是由于這些空腔的存在，使印跡聚合物對(duì)模板物質(zhì)具有良好的選擇性結(jié)合能力。雖然NMIP和乙胺嘧啶也形成氫鍵，但由于位置關(guān)系，不具有作用位點(diǎn)的匹配，阻礙同其它分子的作用，因此，對(duì)乙胺嘧啶的吸附很小，而MIP對(duì)乙胺嘧啶確有特異的吸附性。

2.3 流動(dòng)相的選擇

分離實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相采用甲醇水體系，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，改變流動(dòng)相中水的含量，將引起分離度的變化，采用甲醇/水為25∶75，達(dá)到基線分離。這是因?yàn)楫?dāng)流動(dòng)相中有機(jī)相含量占主要的時(shí)候，氫鍵占主要地位，水的加入導(dǎo)致了聚合物與模板氫鍵強(qiáng)度的減弱，隨著有機(jī)相中水含量的增加，氫鍵越來(lái)越弱，模板與聚合物的離子鍵和疏水作用此時(shí)卻變得越來(lái)越強(qiáng)，分子識(shí)別逐步由氫鍵識(shí)別機(jī)理轉(zhuǎn)化為離子交換機(jī)理和疏水作用所控制。在實(shí)驗(yàn)的過程中常出現(xiàn)基線漂移現(xiàn)象，在流動(dòng)相中加入0.6%的冰乙酸能夠很好的解決這個(gè)問題。本文在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的過程中加入冰乙酸的含量為0.05%～0.80%，含量較低時(shí)仍出現(xiàn)基線漂移現(xiàn)象，含量較高時(shí)基線漂移現(xiàn)象消失但是分離度下降，這是因?yàn)楸宜岷窟^高破壞分子間氫鍵，分子識(shí)別作用變?nèi)?。?shí)驗(yàn)證明冰乙酸的含量為0.6%時(shí)，能更好的防止基線漂移和雜質(zhì)離子干擾。

綜上所述,乙胺嘧啶和敵菌凈的分離實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相采用甲醇/水/冰乙酸為25∶75∶0.6%。

2.4 聚合物對(duì)模板分子及結(jié)構(gòu)類似物的色譜分離

以聚合物作為色譜固定相，制成色譜柱。利用高效液相色譜法對(duì)乙胺嘧啶和結(jié)構(gòu)類似物敵菌凈（結(jié)構(gòu)見圖3）混合溶液進(jìn)行檢測(cè)，見圖4、5。

圖3 乙胺嘧啶與敵菌凈的結(jié)構(gòu)式Fig.3 Molecular graph of pyrimethamine and diaveridine.

圖4 空白聚合物色譜評(píng)價(jià)圖Fig.4 Chromatographic evaluation chart of NMIP

從圖4中可以看出，在非印跡柱上，兩種物質(zhì)均無(wú)保留，并且色譜峰完全重疊。

圖5 印跡聚合物色譜評(píng)價(jià)圖Fig.5 Chromatographic evaluation chart of MIP

從圖5中可以看出，在印跡柱上，二者出峰時(shí)間均加長(zhǎng)了，并且乙胺嘧啶的出峰時(shí)間比敵菌凈的出峰時(shí)間長(zhǎng)，乙胺嘧啶的峰有拖尾，這正是烙印型色譜固定相分離的典型特征。二者達(dá)到了基線分離，說明所制備的乙胺嘧啶印跡聚合物能夠產(chǎn)生很好的孔穴，并且這種孔穴與模板分子的專一匹配程度很好，因此，它能夠達(dá)到對(duì)于乙胺嘧啶與其結(jié)構(gòu)相似物（敵菌凈）的分離。

3 結(jié)論

以乙胺嘧啶為模板分子，在苯甲醇和乙腈混合溶液中制備了乙胺嘧啶分子印跡聚合物，可以識(shí)別模板分子及其類似物，對(duì)乙胺嘧啶呈現(xiàn)了很高的選擇性。以甲醇水為流動(dòng)相，色譜分離乙胺嘧啶和敵菌凈達(dá)到基線分離。繪制不同濃度的吸附量曲線，結(jié)果表明印跡聚合物遠(yuǎn)大于非印跡聚合物的吸附量，說明印跡聚合物對(duì)乙胺嘧啶有特異的吸附性。

［1］郭天瑛,張麗影,郝廣杰.氨基酸衍生物手性分離分子印跡聚合物［J］.化學(xué)進(jìn)展,2004,16（4）:638-642.

［2］錢桂平,余建中.高效液相色譜法測(cè)定魚肉中的乙胺嘧啶［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15（6）:697-698.

［3］林海丹,林峰.高效液相色譜法測(cè)定動(dòng)物源性食品中甲氧芐胺嘧啶藥物殘留［J］.檢驗(yàn)檢疫學(xué),2003,13（5）:5-6.

［4］吳小平,鄒世平,李曉莉，等.鰻鱺血漿與肌肉中乙胺嘧啶檢測(cè)方法的建立［J］.淡水漁業(yè),2007,37（4）:65-68.