人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法的研究

竇慧慧 郭文君 于 麗＊ 馬 麗 孫 麗

(1濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;2濰坊醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室,山東;3濰坊市婦幼保健院, 261042)

間充質(zhì)干細(xì)胞 (mesenchymal stem cells,MSCs)是一類起源于中胚層的成體干細(xì)胞,因其具有自我更新和多向分化潛能,已成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。目前人MSCs主要來(lái)源于成人骨髓和胎兒的臍帶血。但是隨著年齡的增長(zhǎng),成人骨髓中MSCs的含量逐漸下降[1],并且從足月胎兒的胎血中較難獲得MSCs[2]。這使MCSs在臨床上的應(yīng)用受到限制。已有研究發(fā)現(xiàn)臍帶中也能分離出MSCs[3]。

迄今為止,臍帶MSCs尚未得到廣泛應(yīng)用,最關(guān)鍵的原因是臍帶MSCs的分離培養(yǎng)技術(shù)不是很成熟。另外,在臍帶MSCs體外培養(yǎng)中有很多人為因素如選擇的培養(yǎng)基、對(duì)酶的敏感性、PH值、臍帶的新鮮程度等都會(huì)影響臍帶MSCs的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)擬從胎齡、臍帶的新鮮程度、分離方法和培養(yǎng)基四個(gè)方面來(lái)探討臍帶MSCs的培養(yǎng)條件,以期獲得更高的培養(yǎng)成功率。

材料和方法

1.臍帶采集的方法和主要試劑見前期研究[4]

2.臍帶MSCs的分離培養(yǎng) 健康足月剖宮產(chǎn)胎兒的新鮮臍帶采用組織平鋪法[5]分離培養(yǎng)細(xì)胞。將組織塊剪成1×1×1mm3大小,平鋪于培養(yǎng)瓶底,待培養(yǎng)液顏色變化首次全量換液。細(xì)胞傳代的時(shí)間及培養(yǎng)成功的標(biāo)準(zhǔn)同臍血MSCs[4]。

3.胎齡對(duì)MSCs原代培養(yǎng)影響 取4份早產(chǎn)兒 (不足37周)和16份足月妊娠臍帶,用MesencultTM培養(yǎng)基,分別計(jì)算培養(yǎng)成功率。

4.臍帶的新鮮程度對(duì)MSCs原代培養(yǎng)影響將新鮮臍帶分成3段,一段立即用于分離培養(yǎng)細(xì)胞,另兩段臍帶分別放在-20℃和-70℃凍存。次日取出凍存的臍帶快速解凍,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。三份臍帶均采用組織塊平鋪法,MesencultTM培養(yǎng)基,每日觀察記錄。

5.不同分離方法對(duì)MSCs原代培養(yǎng)影響 新鮮臍帶5份,采用0.25%胰酶消化法,另取新鮮臍帶4份,采用雙酶法即胰酶加膠原酶消化法。收集細(xì)胞,接種到培養(yǎng)瓶中,每日觀察記錄。與采用組織塊平鋪法的臍帶MSCs培養(yǎng)成功率進(jìn)行比較。

6.不同培養(yǎng)基對(duì)MSCs原代培養(yǎng)影響 16份采用MesencultTM培養(yǎng)基,11份采用DMEM/F12培養(yǎng)基,16份采用L-DMEM培養(yǎng)基,計(jì)算并比較培養(yǎng)成功率。

結(jié) 果

1.臍 帶MSCs生物學(xué)特性

接種后24h部分組織塊間隙可見紡錘形細(xì)胞(圖1)。貼壁細(xì)胞7d后局部形成集落生長(zhǎng) (圖2),14d左右可達(dá)80%～90%融合,即可傳代。傳代后4h細(xì)胞貼壁,2d后細(xì)胞迅速生長(zhǎng),7d左右可再次傳代。隨著傳代,細(xì)胞形成形態(tài)相對(duì)均一的成纖維細(xì)胞樣 MSCs,平行排列或漩渦生長(zhǎng),即為臍帶MSCs(圖3)。MSCs傳5代后仍為形態(tài)相對(duì)均一的成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞融合后仍是平行排列或漩渦生長(zhǎng)。

2.胎 齡對(duì)臍帶MSCs原代培養(yǎng)影響

16份足月分娩臍帶均能培養(yǎng)出臍帶 MSCs,MSCs增殖旺盛,生長(zhǎng)迅速。4份早產(chǎn)臍帶雖培養(yǎng)條件相同,但僅1份早產(chǎn)臍帶培養(yǎng)1周后組織塊間隙見到極少量紡錘形細(xì)胞,第2-3天紡錘形細(xì)胞消失。其余3份早產(chǎn)臍帶培養(yǎng)1月均未見到紡錘形細(xì)胞出現(xiàn)。

3.臍 帶的新鮮程度對(duì)臍帶MSCs原代培養(yǎng)影響

-20℃和-70℃凍存的臍帶在培養(yǎng)1月左右均未見紡錘形細(xì)胞,而新鮮臍帶均成功培養(yǎng)出MSCs。

4.分 離方法對(duì)臍帶MSCs原代培養(yǎng)的影響

足月妊娠分娩的新鮮臍帶,采用MesencultTM培養(yǎng)基,其中16份臍帶采用組織塊平鋪法均能培養(yǎng)出MSCs。采用胰酶消化方法和雙酶法處理的臍帶雖也采用MesencultTM培養(yǎng)基,但未能培養(yǎng)出MSCs。

5.不 同培養(yǎng)基對(duì)臍帶MSCs原代培養(yǎng)的影響

與MesencultTM培養(yǎng)基比較,DMEM/F12培養(yǎng)基和L-DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,排列稀疏,原代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng) (4-6周)。傳代后細(xì)胞貼壁慢,增殖也較緩慢。

足月分娩臍帶,相同培養(yǎng)條件,其中18份采用MesencultTM培養(yǎng)基,均獲得MSCs,培養(yǎng)成功率100%;11份采用DMEM/F12培養(yǎng)基,其中5份獲得MSCs,培養(yǎng)成功率45.45%;16份采用DMEM培養(yǎng)基,其中7份獲得MSCs,培養(yǎng)成功率43.75%。分別于培養(yǎng)的第4、7、10、14d測(cè)定每400倍視野下各組 MSCs的數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MesencultTM培養(yǎng)基組臍帶MSCs數(shù)目較DMEM/F12培養(yǎng)基和L-DMEM培養(yǎng)基組多,且生長(zhǎng)迅速(P<0.05)(見表1),差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

6.表面標(biāo)記檢測(cè) 傳3代后臍帶MSCs高表達(dá)CD29、CD90、CD44(圖4),幾乎不表達(dá)造血系標(biāo)志CD34。與臍血MSCs結(jié)果相同,也與已有文獻(xiàn)報(bào)道相同。

清潔機(jī)器人沿所鋪設(shè)的履帶節(jié)向前滑動(dòng)時(shí)需要克服兩者之間的摩擦阻力以及重力沿工作平面的分量?？朔@個(gè)摩擦阻力的驅(qū)動(dòng)力由履帶節(jié)對(duì)驅(qū)動(dòng)鏈輪的反向作用力提供[5]，通過(guò)對(duì)清潔機(jī)器人的受力分析可知：

表1 人臍帶MSCs培養(yǎng)中不同培養(yǎng)基的比較 (n=30,ˉx±s)T able 1 Comparison of different culture media in the culture of human umbilical cord MSCs(n=30, ˉx±s)

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSCs)是來(lái)源于胚胎發(fā)育早期中胚層的多能干細(xì)胞,在特定細(xì)胞因子和理化環(huán)境的作用下可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[6,7]。MSCs因不受免疫排斥等的限制,近年來(lái)在細(xì)胞移植和基因治療等領(lǐng)域備受關(guān)注[8,9]。

目前人MSCs的來(lái)源多為成人骨髓、臍血,亦有從臍帶中分離出MSCs的報(bào)道。骨髓MSCs隨供者年齡增長(zhǎng)數(shù)量和增殖分化能力都下降,而且本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn)足月兒的臍血中分離出MSCs的成功率僅為66.67%[4],這些都限制了骨髓和臍血MSCs的廣泛應(yīng)用。臍帶MSCs采集方便,不會(huì)給胎兒及產(chǎn)婦帶來(lái)痛苦和不利影響并且病毒感染機(jī)率低,培養(yǎng)成功率較高,這些優(yōu)點(diǎn)是骨髓和臍血MSCs無(wú)法比擬的。故我們希望找到分離培養(yǎng)臍帶MSCs的最佳方法。

胚胎形成過(guò)程中,滋養(yǎng)層細(xì)胞形成胎膜、臍帶、胎盤,內(nèi)細(xì)胞群形成胎兒。Romanov等[10]認(rèn)為胎兒血循環(huán)中MSCs隨胎兒的成熟,大部分定位在臍靜脈內(nèi)皮下層和胎盤。這可以部分解釋臍帶富含MSC的原因。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),足月產(chǎn)胎兒臍帶MSCs培養(yǎng)成功率遠(yuǎn)高于早產(chǎn)兒臍帶MSCs培養(yǎng)成功率,這與Romanov的觀點(diǎn)相符合。

目前主要是從新鮮組織中分離培養(yǎng)細(xì)胞,也有從凍存組織中成功分離培養(yǎng)細(xì)胞的報(bào)道[12]。本實(shí)驗(yàn)將-20℃和-70℃凍存臍帶進(jìn)行MSCs分離培養(yǎng),計(jì)算其成功率,與相同培養(yǎng)條件下新鮮臍帶MSCs分離培養(yǎng)成功率相比較,發(fā)現(xiàn)新鮮臍帶更利于臍帶MSCs的分離培養(yǎng)。其原因可能為:(1)MSCs屬較原始的細(xì)胞,凍存后不易存活;(2)臍帶在凍存及解凍過(guò)程中與外界接觸時(shí)間較長(zhǎng),增加了污染的機(jī)率;(3)臍帶在凍存過(guò)程中處理不當(dāng),致使大部分細(xì)胞活性喪失,從而難以分離培養(yǎng)出細(xì)胞。

臍帶中的華通膠,由成纖維細(xì)胞、膠原纖維和蛋白多糖組成,其內(nèi)富含MSCs[11],理論上通過(guò)胰酶和膠原酶消化可以直接獲得臍帶MSCs,故本實(shí)驗(yàn)采用酶消化法進(jìn)行臍帶MSCs分離培養(yǎng),但未能成功分離培養(yǎng)出MSCs。采用酶消化法效果不好的原因可能是臍帶組織中成分比較復(fù)雜,酶難以將其消化,也可能是在用酶消化過(guò)程中,酶在消化組織分離細(xì)胞的同時(shí)將細(xì)胞也消化了。其原因有待于進(jìn)一步探討。

培養(yǎng)基是影響細(xì)胞培養(yǎng)成功與否的一個(gè)重要因素。目前用于培養(yǎng)臍帶MSCs的培養(yǎng)基大部分為L(zhǎng)-DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清。本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)臍血/帶MSCs培養(yǎng)基的研究中,發(fā)現(xiàn)采用MesencultTM培養(yǎng)基培養(yǎng)的成功率較高,細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,細(xì)胞形態(tài)均一,原代培養(yǎng)時(shí)間短 (約2～3周),并且能保持MSCs處于未分化狀態(tài)。而采用DMEM/F12培養(yǎng)基和L-DMEM培養(yǎng)基,臍帶MSCs生長(zhǎng)緩慢,原代培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng) (約 4～6周),這說(shuō)明MesencultTM培養(yǎng)基是一種更適合臍帶MSCs生長(zhǎng)的優(yōu)良培養(yǎng)基。

綜上所述,采用新鮮足月分娩臍帶和MesencultTM培養(yǎng)基所培養(yǎng)出的MSCs形態(tài)較一致,且細(xì)胞成分較純。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了人臍帶MSCs的培養(yǎng)方法,為人臍帶MSCs的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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圖 版 說(shuō) 明

圖1 原代培養(yǎng)臍帶MSCs,接種后24h,MesencultTM培養(yǎng)基 (×200)

圖2 原代培養(yǎng)臍帶MSCs,接種后7d,MesencultTM培養(yǎng)基 (×200)

圖3 傳一代臍帶MSCs,接種后7d,MesencultTM培養(yǎng)基(×200)

圖4 臍帶MSCs CD44陽(yáng)性表達(dá),免疫熒光法 (×400)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Umbilical cord MSCs in primary culture,cultured for 24h.MesencultTMmedium(×200)

Fig.2 Umbilical cord MSCs in primary culture,cultured for 7d.MesencultTMmedium(×200)

Fig.3 Umbilical cord MSCs in first passage culture,cultured for 7d.MesencultTMmedium(×200)

Fig.4 Umbilical cord MSCs expressing CD44.Immunofluo

rescence method(×400)