轉錄因子Ets-1與MMP-9在胃癌中的表達及臨床意義

趙文娣 吳繼鋒 張 紅 秦 蓉 沈裕欣 王道斌

(安徽醫(yī)科大學病理學教研室,合肥230032; 1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室,合肥230022)

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一,臨床上腫瘤復發(fā)和轉移是導致其治療失敗的主要原因。腫瘤浸潤轉移的兩個必要條件為腫瘤細胞侵犯并穿越基膜及細胞外基質所組成的屏障和腫瘤血管生成。研究發(fā)現(xiàn),Ets轉錄因子家族成員 Ets-1(E26 tansformation-specific-1),通過轉錄激活一系列在細胞外基質重建和血管生成中起重要作用的基因的表達,如基質金屬蛋白酶 (MMP)-1,-3,-9和尿激酶型纖溶酶原激活物 (uPA)等,在腫瘤浸潤轉移中發(fā)揮重要作用[1]。目前國內外在胃癌中關于Ets-1與MMP-9的相關性研究未見報道。本研究采用免疫組化方法檢測 Ets-1及MMP-9在胃癌、癌旁組織、正常胃黏膜組織中的表達,探討兩者在胃癌浸潤轉移中的作用、相互關系及臨床意義。

材料和方法

1.材料 收集安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科1999-2004年間胃癌手術切除標本97例,患者術前均未接受過抗腫瘤治療。其中男75例,女22例;年齡29-76歲,中位年齡56歲。歸類如下[2]:組織學類型:乳頭狀腺癌11例,管狀腺癌49例,低分化腺癌20例,印戒細胞癌10例,黏液腺癌7例。浸潤深度:侵及漿膜者76例,未及漿膜者21例。有淋巴結轉移者75例,無淋巴結轉移者22例。臨床 TNM分期:Ⅰ、Ⅱ期34例,Ⅲ、Ⅳ期63例。以97例癌旁組織以及另選取28例胃良性病變正常胃黏膜組織為對照。所有標本組織經(jīng)10%甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋,4μm厚連續(xù)切片,分別進行HE和免疫組化染色。

2.主要試劑與方法 兔抗人Ets-1多克隆抗體(C-20)購自美國 Santa Cruz公司,稀釋度為1:200;即用型鼠抗人 MMP-9單克隆抗體(BA0362)購自福建邁新生物技術開發(fā)公司。免疫組化S-P法,操作按說明書進行,DAB顯色。每批染色均用已知陽性切片作陽性對照 (Ets-1用人腎上腺組織,MMP-9用人乳腺癌組織),用 PBS代替一抗作陰性對照。

3.結果判定 免疫組化結果由兩名醫(yī)師記錄,并獨立閱片。每例選擇10個高倍視野 (×40),Ets-1以細胞胞質和 (或)細胞核內出現(xiàn)黃色或黃褐色顆粒為陽性[3]。MMP-9以胞質出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。按陽性細胞數(shù)占視野中總細胞數(shù)的百分比分為3級:<10%為陰性 (-);10%-50%之間為陽性 (+);>50%為強陽性 (++)。

4.統(tǒng)計學分析使用SPSS 13.0 for window軟件進行統(tǒng)計學處理,根據(jù)資料性質分別采用Wilcoxon秩和檢驗、Kruskal-Wallis法、χ2檢驗。

結 果

1.E ts-1和MMP-9在正常胃黏膜、癌旁組織及胃癌組織中表達

Ets-1陽性染色定位于細胞質和 (或)細胞核內。Ets-1主要表達于胃癌細胞 (圖1),在97例胃癌組織中陽性率為74.2%(72/97);部分癌旁黏膜組織中也見Ets-1陽性表達,主要見于腸化和非典型增生上皮 (圖2),陽性率為40.2%(39/97);在28例正常胃黏膜組織中,Ets-1陽性表達僅局限于固有層腺體內的少量細胞 (圖3),陽性率為17.9%(5/28),且無強陽性表達。MMP-9主要表達于胃癌細胞胞質中 (圖4)。MMP-9在胃癌組織、癌旁組織、正常胃黏膜組織中陽性率分別為75.3%、18.6%、14.3%。Ets-1和 MMP-9在胃癌組織中的表達率明顯高于癌旁組織及正常胃黏膜組織 (P<0.05);而癌旁組織及正常胃黏膜組織中的表達差異無顯著性 (P>0.05)。

根據(jù)不同組織學類型分組比較,Ets-1和MMP-9表達與胃癌組織學類型有明顯相關性,在黏液癌 (印戒細胞癌/黏液腺癌)中的表達明顯低于其它類型癌中的表達 (P<0.01)(見圖5、6,表1)。

2.E ts-1、MMP-9的表達與胃癌臨床病理因素間的關系

Ets-1和MMP-9在侵及漿膜組的胃癌組織中表達明顯高于未及漿膜組 (P<0.01),在有淋巴結轉移組表達明顯高于無淋巴結轉移組 (P<0.01);臨床分期中Ⅲ、Ⅳ期組表達明顯高于Ⅰ、Ⅱ期組 (P<0.01),而與年齡、性別、腫瘤大小及腫瘤位置均無關 (P>0.05)(見表2)。

3.E ts-1和MMP-9在胃癌組織中表達的關系

胃癌組織中Ets-1和MMP-9蛋白表達均陽性者67例 (69.1%),均為陰性者19例 (19.6%)。Ets-1陽性而 MMP-9陰性 5例;Ets-1陰性而MMP-9陽性6例。兩者表達呈正相關 (r=0.700,P<0.01)。(表 3)。

表1 胃癌各組織類型、癌旁組織及正常胃黏膜組織中Ets-1、MMP-9蛋白的表達Table 1 The expressions of Ets-1 and MMP-9 protein in histologic types of GC,adjacent tissue and in normal gastric mucosal tissue

表2 胃癌組織中Ets-1和MMP-9的表達與臨床病理因素的關系T able 2 Relationship between Ets-1,MMP-9 positive expressions and clinical pathological features of GC

表3 胃癌組織中 Ets-1和MMP-9蛋白表達之間的關系T able 3 Relationship between Ets-1 and MMP-9 protein in GC

討 論

Ets-1基因是從禽類白血病逆轉錄病毒E26基因組中分離出的癌基因,其編碼產(chǎn)物Ets-1是一種轉錄因子,Ets-1是Ets家族中具有代表性的成員。Ets家族是一組轉錄因子群,它們都具有由85個氨基酸構成的進化保守的DNA結合區(qū),形成一個螺旋-轉角-螺旋 (helix-turn-helix)結構,稱為Ets結構域 (Ets domain),這個結構域識別靶基因啟動子區(qū)的一個富含嘌呤的 GGAA/T核心基序[1]。Ets-1作為轉錄因子參與細胞的增殖分化、血管生成、細胞凋亡等過程,同時在腫瘤浸潤轉移中也發(fā)揮重要作用,主要與某些降解細胞外基質酶的轉錄激活有關,這些酶包括基質金屬蛋白酶 (MMPs)等[4]。

Nakayama等[3]認為 Ets-1高表達可能是胃癌多步驟發(fā)生過程的一個環(huán)節(jié)。Nagarajan等[5]通過研究高表達 Ets-1的轉基因老鼠發(fā)現(xiàn),Ets-1在皮膚鱗癌的發(fā)生中起作用,Ets-1高表達可以誘發(fā)老鼠皮膚鱗狀上皮出現(xiàn)非典型增生、甚至深部浸潤的表現(xiàn),同時伴有MMPs表達升高。本研究發(fā)現(xiàn),Ets-1和MMP-9在胃癌組織中均有較高的陽性表達率,且明顯高于正常胃黏膜及癌旁組織,提示胃粘膜中Ets-1高表達可能對胃癌發(fā)生、發(fā)展起重要作用。我們推測Ets-1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中所起的作用可能是通過其下游分子MMPs等,增強了細胞分解基底膜及形成新生血管的能力。也可能因其本身是一種原癌基因,過表達進而促進了細胞的惡性轉化。

研究同時發(fā)現(xiàn),在胃癌不同組織學分型中,印戒細胞癌和黏液腺癌Ets-1的陽性表達率顯著低于乳頭狀腺癌、管狀腺癌及低分化腺癌,甚至低于癌旁組織。我們推測由于腫瘤浸潤轉移受多種機制調控,黏液癌具有與其它組織學類型不同的浸潤轉移機制[3];也可能和黏液癌的組織起源與其它類型不同有關。

MMPs是一組與腫瘤浸潤轉移關系十分密切的蛋白水解酶,MMP-9是MMPs家族中的重要成員,又稱為 IV型膠原酶 (type IV collagenase)或明膠酶B(gelatinase B),其作用底物為明膠蛋白、IV和V型膠原等構成 ECM的重要成份。MMP-9通過破壞基底膜和對細胞外基質的改建,促進腫瘤新生血管的形成,利于腫瘤的浸潤轉移。本研究發(fā)現(xiàn),Ets-1和MMP-9的高表達與胃癌浸潤深度、淋巴結轉移及臨床分期有關,且胃癌組織中Ets-1和MMP-9的表達具有顯著相關性。Ets-1作為轉錄因子對MMP-9蛋白的表達具有誘導作用:Ets-1識別靶基因上的一段中心為 GGAA/T核心基序,稱為 Ets結合位點 (Ets binding site,EBS)或 PEA3元件 (PEA3 element)。所有MMPs基因的啟動子區(qū) (除MMP-12外)都含有PEA3元件。Ets-1通過與轉錄因子AP-1(c-fos/c-jun)的協(xié)同作用,激活MMPs基因[4,6]。我們推測通過上調MMP-9的表達,使基底膜及細胞外基質降解,可能是Ets-1促進胃癌浸潤轉移的機制之一。通過上調基質降解酶類的表達,增強對細胞外基質的降解,使癌細胞向組織深層浸潤的同時也突破淋巴管和血管的基底膜而向脈管浸潤,最終發(fā)生轉移。

因此可以設想通過抑制Ets-1的活性達到抑制腫瘤浸潤轉移的目的。Sahin[7]等用一顯性失活的無轉錄激活功能的 Ets-1-DB蛋白競爭抑制 Ets-1,發(fā)現(xiàn)逆轉錄病毒介導的 Ets-1-DB蛋白抑制了膠質瘤細胞的增殖、侵襲及腫瘤細胞MMP-9的表達。Taniguchi[8]等采用 decoy寡核酸技術,向胃癌細胞裸鼠腹腔內種植的動物模型腹內注射Ets-1 decoy寡核苷酸后,抑制了種植瘤的生長,延長了實驗動物的生存期?？傊?隨著研究的深入,針對轉錄因子Ets-1的靶向抑制可能為胃癌治療提供新的思路。

〔1〕Dittmer J.The biology of the Ets1 proto-oncogene.Mol cancer,2003,2(29):1-21

〔2〕Hamilton SR,Aaltonen LA.World Health Organization classification of tumors.Pathology and genetics of tumors of digestive system.Lyon:IARC Press,2000,38-46

〔3〕Nakayama T,Ito M,Ohtsuru A,et al.Expression of Ets-1 proto-oncogene in human gastric carcinoma:correlation with tumor invasion.Am J Pathol,1996,149(6):1931-1939

〔4〕Singh S,Barrett J,Sakata K,et al.Ets proteins and MMPs:partners in invasion and metastasis.Curr Drug Targ,2002,3(5):359-367

〔5〕Nagarajan P,Parikh N,Garrett-Sinha LA,et,al.Ets1 Induces Dysplastic Changes When Expressed in Terminally-Differentiating Squamous Epidermal Cells.PLoS one,2009,4(1):1-15

〔6〕Okuducu AF,Zils U,Michaelis SA,et al.Increased expression of avian erythroblastosis virus E26 oncogene homolog 1 in World Health Organization grade 1 meningiomas is associated with an elevated risk of recurrence and is correlated with the expression of its target genes matrix metalloproteinase-2 and MMP-9.Cancer,2006,107(6):1365-1272

〔7〕Sahin A,Vercamer C,Kaminski A,et al.Dominantnegative inhibition of Ets 1 suppresses tumor growth,invasion and migration in rat C6 glioma cells and reveals differentially expressed Ets 1 target genes.Int J Oncol,2009,34(2):377-389

〔8〕Taniguchi H,Fujiwara Y,Doki Y,et al.Gene therapy using ets-1 transcription factor decoy for peritoneal dissemination of gastric cancer.Int J Cancer,2007,121(7):1609-1617

圖 版 說 明

圖1管狀腺癌Ets-1強陽性表達 (++),定位于癌細胞胞質及胞核 (S-P法 ×400)。

圖2癌旁組織 Ets-1弱陽性表達 (+)。(S-P法 ×100)。

圖3正常胃黏膜組織 Ets-1弱陽性表達 (+) (S-P法 ×100)。

圖4管狀腺癌MMP-9強陽性表達 (++),定位于癌細胞胞質 (S-P法 ×400)

圖5印戒細胞癌 Ets-1陰性表達 (-)(S-P法 ×100)。

圖6粘液腺癌MMP-9陰性表達 (-)(S-P法 ×100)

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 The expression of Ets-1 protein is strong positive in cytoplasm and mucleioftubularadenocarcinoma(++).S-P method×400

Fig.2 The expression of Ets-1 protein is weak positive in pericancerous tissue(+).S-P method ×100。

Fig.3 The expression of Ets-1 protein is weak positive in normal mucosa(+).S-P method×100

Fig.4 The expression of MMP-9 protein is strong positive in cytoplasm of tubular adenocarcinoma(+ +).S-P method ×400。

Fig.5 The expression of Ets-1 protein is negative in signetring cell carcinoma(-).S-P method×100

Fig.6 The expression of MMP-9 protein is negative in mucinous adenocarcinoma(-).S-P method×100