siRNA 抑制Survivin基因?qū)Υ竽c癌細(xì)胞 HCT116增殖及凋亡的的影響

曹立宇 丁麗紅 尹 玉 江 燕 李 昊 張洪福

(1安徽醫(yī)科大學(xué)病理教研室,合肥230032;2溫州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科,浙江,325027)

大腸癌 (colorectal carcinoma,CRC)是人類常見的惡性腫瘤之一,目前主要的治療方法是手術(shù)切除,術(shù)后結(jié)合放療及化療,但多數(shù)患者治療效果不佳,容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,死亡率較高。近年來隨著對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)研究,提出了基因治療的概念。前期的研究表明凋亡抑制基因Survivin高表達(dá)在大腸癌的發(fā)生中起重要作用,并與患者預(yù)后有關(guān)[1]。本研究應(yīng)用 RNA干擾技術(shù)(RNA interference,RNAi),將針對(duì)凋亡抑制蛋白Survivin特異靶點(diǎn)的小干擾RNA (small interferingRNA,siRNA)轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞系HCT116,探討siRNA抑制 Survivin基因后對(duì)大腸癌細(xì)胞系生物學(xué)行為的影響,為進(jìn)一步以Survivin為靶點(diǎn)的基因治療提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細(xì)胞來源 人大腸癌細(xì)胞株HCT116來源于低分化腺癌,購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 兔抗人Survivin多克隆抗體(RAB-0536)及廣譜免疫組化S-P試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司,β-actin一抗、二抗為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。針對(duì)Survivin的siRNA序列由上海閃晶分子生物技術(shù)研究所合成,基因序列為:Sense 5’-GGA CCA CCG CAU CUC UAC AdTd-3’,Anti-sense 5’-U GU AGA GAU GCG GU G GUC C dTd-3’。脂質(zhì)體Lipofectamine 2000為 Invitrogen公司產(chǎn)品,OPTI-MEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)液為 GIBCO公司產(chǎn)品,MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。Annexin V-FITC PI染色試劑盒為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng) 人大腸癌細(xì)胞系HCT116細(xì)胞復(fù)蘇后,加入含10%FBS的RPMI-1640營養(yǎng)液,37℃恒溫密閉式5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),每2-3天傳代一次,選擇50代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞傳6孔板后,將配制的siRNA-Lip混和液加入含有細(xì)胞和轉(zhuǎn)染液的孔中,使每孔轉(zhuǎn)染總體積為1 ml,37℃培養(yǎng)6h;換新鮮不含抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至24 h,棄去培養(yǎng)液,換用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。

2.3 細(xì)胞分組 正常對(duì)照組 (Opti-MEM培養(yǎng)基),脂質(zhì)體對(duì)照組 (含Lip-2000的Opti-MEM培養(yǎng)基),陰性錯(cuò)配對(duì)照組 (含Lip-2000的Opti-MEM培養(yǎng)基加錯(cuò)配的 siRNA),脂質(zhì)體+Survivin-siRNA組。

2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 (S-P法) 按試劑盒說明書操作,用已知陽性切片作陽性對(duì)照,用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

2.5 Western blot 用4℃預(yù)冷的PBS洗凈培養(yǎng)液,吸干后每皿細(xì)胞加50μl含PMSF的裂解液,冰上裂解1h,4℃下12000rpm離心30min;取上清BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量。取含50μg蛋白質(zhì)的溶液體積為上樣量,加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×SDS,煮沸10min使蛋白質(zhì)變性;10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (130V)2小時(shí);在80v電流下轉(zhuǎn)膜2小時(shí)至硝酸纖維素膜上;用5%脫脂奶粉/TBST室溫封閉30min;分別加入Survivin、Actin一抗 (1:500),4℃孵育過夜后,TBST洗膜3次,每次10min;加入二抗 IgG(1:5000),室溫孵育2h;ECL顯色,X膠片顯影;

2.6 MTT實(shí)驗(yàn) 每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔;轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,每孔加入 20μl 0.5%MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4h;每孔加入150μl二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的OD490nm波長處吸光度值;重復(fù)三次后,計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對(duì)照組OD值) ×100%。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖凋亡 轉(zhuǎn)染48小時(shí)后,用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞15分鐘,用1×Buffer A洗滌細(xì)胞一次 (離心 2000rpm,5min),收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml;加入9倍體積的70%乙醇,于-20℃固定12小時(shí);離心收集細(xì)胞后,除去乙醇,細(xì)胞重懸于500μl Buffer A中;加入 RnaseA使其終濃度為 0.25mg/ml,37℃,反應(yīng) 30min;加入 5μl PI室溫避光染色30min,按Annexin V-FITC PI染色試劑盒說明書操作,流式細(xì)胞儀檢測。

2.8 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,計(jì)數(shù)資料采用Χ2檢驗(yàn)或 Fisher精確概率計(jì)算法,陽性率之間的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析比較,計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (ˉx±s)表示,多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析,然后用SN K進(jìn)行兩兩比較。兩個(gè)率之間的比較采用泊松分布兩樣本率的Z檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 Survivn陽性信號(hào)主要定位于細(xì)胞漿呈黃-棕黃色,免疫細(xì)胞化學(xué)顯示HCT116細(xì)胞系的正常對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組及陰性錯(cuò)配對(duì)照組細(xì)胞漿均呈深棕黃色表達(dá) (強(qiáng)陽性);Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染組陽性程度明顯減弱,呈淡黃色表達(dá) (弱陽性)。重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。見圖1。

圖1 A.HCT116細(xì)胞。HE×4001B.Survivin在陰性錯(cuò)配對(duì)照組 HCT116中陽性表達(dá)SP法 ×4001C.Survivin在 Survivin-siRNA組 HCT116中弱陽性表達(dá)。SP法 ×4001D.Survivin在正常對(duì)照組 HCT116中強(qiáng)陽性表達(dá)。SP法 ×400Fig.1A:HCT116 cells(HE staining×400)1B:Positive expression in negative mismatched control group.SP method×4001C:HCT116 cells showing weakly positive in survivinsiRNA interfered group.SP method×4001D:HCT116 cells showing positive expressing of survivin in the normal control group.SP method×400

2 Western blot結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示HCT116細(xì)胞系的Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染組,其蛋白條帶亮度均明顯低于正常對(duì)照組、脂質(zhì)體對(duì)照組和陰性錯(cuò)配對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)均用β-actin作內(nèi)參照,重復(fù)三次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。見圖2。

圖2 Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染抑制 HCT116的Survivin蛋白表達(dá)1:正常對(duì)照組 2:脂質(zhì)體對(duì)照組 3:陰性錯(cuò)配對(duì)照組 4:Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染組Fig.2 siRNA successfully inhibits survivin protein expression in colon cancer HCT116 cell line.1:Normal control group. 2:Lipofectamine 2000 control group.3:Mismatched control group.4:Survivin-siRNA interfered group.

3 MTT結(jié)果 以正常對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率為0,計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率。SurvivinsiRNA轉(zhuǎn)染組與其空白對(duì)照組及陰性錯(cuò)配對(duì)照組相比,細(xì)胞增殖的OD490值降低,其增殖抑制率明顯高于空白對(duì)照組及陰性錯(cuò)配對(duì)照組 (P<0.05),隨著時(shí)間增加 (24h,48h,72h),增殖抑制率逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=248.09,P<0.05)。(見表 1)。

表1 Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染后不同作用時(shí)間HCT116細(xì)胞系的增殖抑制率 (%)T able 1 The proliferation inhibition rates of HCT116 cell lines after Survivin-siRNA transfection(%)

＊P<0.05,HCT116細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染Survivin-siRNA后24h、48h、72h,與對(duì)照組比較。

＊P<0.05,Compared with blank control and negative mismatched group at different times(24h,48h,72h),respectively.△P<0.05,Compared between different time point(24h,48h,72h)after survivin-siRNA transfection.

△P<0.05,Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后,不同時(shí)間階段間比較。

4流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測用針對(duì)Survivin特異靶點(diǎn)的siRNA轉(zhuǎn)染 HCT116細(xì)胞48h后,結(jié)果顯示空白對(duì)照和陰性錯(cuò)配對(duì)照細(xì)胞組凋亡細(xì)胞數(shù)目少,能指示凋亡的亞二倍體峰不明顯 (M1值),兩者相比無明顯差異。Survivin-siRNA組出現(xiàn)明顯亞二倍體峰,細(xì)胞凋亡比例為22.16%。見表2,圖3。

表2 Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞系的凋亡比例T able 2 The apoptosis rates of HCT116 cell lines after Survivin-siRNA transfection

圖3 流式細(xì)胞儀檢測 HCT116轉(zhuǎn)染48小時(shí)細(xì)胞凋亡。N:正常對(duì)照組,M:陰性錯(cuò)配對(duì)照組,HCT116:Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染組Fig.3 Flow cytometric analysis of HCT116 cells at 48 h after transfection with different siRNAs.The percentage of the pre-G 0-G 1 population(peak)is reported in each histogram.The peak indicates apoptosis rate of cells.N:Normal control group.M:Mismatched group.HCT116:Survivin-siRNA group.

討 論

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的重要成員,Survivin是1997年由耶魯大學(xué)的Ambrosini等利用效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體-I的cDNA在人類基因組文庫中篩選克隆出來的[2]。Survivin基因位于人類染色體l7q25,全長14.7kb,由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子構(gòu)成,編碼含142個(gè)氨基酸殘基、分子量為16.5kDa的胞漿蛋白。其能和紡垂體微管上的微管蛋白結(jié)合,抑制細(xì)胞凋亡[3]。研究發(fā)現(xiàn)Survivin在人的胚胎組織和多種腫瘤組織表達(dá),而在正常組織不表達(dá)或低表達(dá)[4]。RNA干擾是自然界生物體的一種遺傳現(xiàn)象,可以誘導(dǎo)目的基因沉默,高效、特異地抑制目的基因表達(dá)。小干擾RNA具有許多傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)勢,包括特異性、高效性和放大效應(yīng)[5-7],是目前靶向封閉目的基因的最佳選擇。

研究應(yīng)用RNA干擾技術(shù),將針對(duì)Survivin特異靶點(diǎn)的小干擾RNA轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞系HCT116,免疫細(xì)胞化學(xué)顯示陽性細(xì)胞數(shù)無明顯減少,但陽性程度減弱(弱陽性);Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示siRNA轉(zhuǎn)染組的Survivin蛋白量同空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比明顯降低。上述結(jié)果提示Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染能抑制凋亡抑制基因Survivin的蛋白表達(dá)。

Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染后,細(xì)胞的增殖受到明顯抑制,細(xì)胞生長速度明顯變慢,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或凋亡增加,其原因可能是Survivin-siRNA轉(zhuǎn)染人大腸癌細(xì)胞系后,SurvivinSurvivin蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失,抑制多種因素如p53、Caspase等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用減弱[8-9],導(dǎo)致有絲分裂過程中染色質(zhì)分離錯(cuò)誤,從而啟動(dòng)細(xì)胞周期中的自動(dòng)檢查機(jī)制,促發(fā)異常細(xì)胞凋亡[10]。Ikeguchi等[11]應(yīng)用RT-PCR方法檢測肝細(xì)胞癌中Survivin基因mRNA的表達(dá)量,證實(shí)Survivin的高表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞分裂,導(dǎo)致細(xì)胞增殖過度。因此,Survivin基因被抑制后,細(xì)胞的增殖率下降,細(xì)胞的生長受到抑制。

總之,Survivin表達(dá)在大腸癌的發(fā)生中起重要作用,利用RNA干擾技術(shù),將針對(duì)Survivin的siRNA轉(zhuǎn)染大腸癌細(xì)胞后能明顯降低Survivin蛋白表達(dá),細(xì)胞生長被抑制,凋亡增加,為進(jìn)一步以Survivin為靶點(diǎn)的大腸癌的靶基因治療提供了理論依據(jù)。

〔1〕丁麗紅,吳文清,曹立宇,等.Survivin與VEGF及其受體FLT-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,43(6):635-637.

〔2〕Ambrosini G,Adida C,Altieri DC.A novel anti-apoptosis gene,survivin expressed in Cancer and Lymphoma.Nat Med,1997,3(8):917-921.

〔3〕Conway EM,Pollefeyt S,CornelissenJ et al.Three differentially expressed Survivin cDNA variants encode proteins with distinct anliapoptotie functions.Blood,2000,95(4):1435-1442

〔4〕Suzuki A,Hayashida M,Ito T,et al.Survivin initiates cell cycle entry by the competitive interaction with Cdk4/p16(INK4a)and Cdk2/cyclin E complex activation.Oncogene,2000,19(29):3225-3234.

〔5〕Davenpork RJ.G ene Silencing:A faster way to shut down genes.Science,2001,292(5521):1469-1471

〔6〕Hannon G J.RNA interference.Nature,2002:418(6894):244-251

〔7〕Couzin J,Breakthrough of the year,Small RNAs made big splash.Science,2002,298(5602):2296-2297

〔8〕Li F,Ambrosini G,Chu EY,et a1.Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin.Nature,1998,396(6711):580-584.

〔9〕Grossman D,K im PJ,Blanc-Brude OP,et a1.Transgenic expression of survivin in keratinocytes counteracts UVB-induced apoptosis and cooperates with loss of p53.J Clin Invest,2001,108(7):991-999

〔10〕Kawasaki H,T oyoda M,Shinohara H,et al.Expression of survivin correlates with apoptosis,proliferation,and angiogenesis during human colorectal tumorigenesis.Cancer,2001,91(11):2026-2032

〔11〕Ikeguchi M,Ueda T,Sakatani T,et a1.Expressionof Survivin messenger RNA correlates with poor prognosis in patients withhepatocellular carcinoma.Diagn Mol Pathol,2002,11(1):33-40