養(yǎng)精種玉湯正丁醇部位的HPLC指紋圖譜研究

王 巖， 馬紅霞， 黃妙嫦， 周 念， 王 嬰

(1.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510120)

養(yǎng)精種玉湯系中醫(yī)經(jīng)典名方，始載于《傅青主女方》［1］，臨床上多用于女性身瘦血虛不孕證且療效顯著。大量動物實驗數(shù)據(jù)顯示，養(yǎng)精種玉湯可促進小鼠的排卵［2］，刺激家兔顆粒細胞雌二醇的生成［3］;在臨床上，養(yǎng)精種玉湯治療女性月經(jīng)過少或閉經(jīng)等病例，療效滿意［4］。湯劑是制備其他中藥制劑的基礎(chǔ)劑型，將指紋圖譜技術(shù)應(yīng)用于該制劑的質(zhì)量控制，可為養(yǎng)精種玉湯的進一步研究及其制劑開發(fā)提供參考和依據(jù)，并為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(LC-10AT，日本島津);色譜柱(Gemini C18柱，柱號403431-6，廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52A型，上海亞榮化儀器廠);超聲波清洗器(KQ3200型，昆山市超聲儀器有限公司)。馬錢苷，批號111640-200503，芍藥苷，批號110736-200732，阿魏酸對照品，批號110773-200611，中國藥品生物制品檢定所;甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。白芍、山茱萸、當(dāng)歸、熟地黃藥材由廣州中芝源中藥有限公司提供，經(jīng)筆者鑒定符合《中國藥典》2005年版一部的規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Gemini C18柱(250 mm×4.6 mm，粒度5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脫(洗脫程序見表1);流速:1.0 mL/min;檢測波長:225 nm;柱溫:25℃。

2.2 供試品溶液的制備 按處方比例稱取白芍20 g，山茱萸20 g，當(dāng)歸20 g，熟地黃40 g，加入6倍量蒸餾水，于回流裝置中加熱提取2次，每次1 h，提取液濾過，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中60℃減壓濃縮至100 mL，加入95%乙醇使溶液的含醇量為70%，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇，放冷，加蒸餾水至100 mL，先后用乙酸乙酯、正丁醇等體積萃取3次，收集正丁醇液，蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL，即得。同法制成單味藥材供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取馬錢苷、芍藥苷、阿魏酸對照品4.04，6.02，12.57 mg，加甲醇制成每1 mL各含0.032 32，0.048 16，0.125 7 mg 的溶液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例稱取處方中的三味藥材(去掉其余一味藥材)，按供試品溶液的制備方法操作，分別制得缺白芍、缺山茱萸、缺當(dāng)歸、缺熟地黃的陰性對照溶液。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液20 μL，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值均小于3%［5］，表明本法的精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取同一批養(yǎng)精種玉湯樣品，按供試品溶液的制備方法分別制備6份溶液，精密吸取20 μL進樣測定。結(jié)果各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值均小于3%，表明本法的重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取取同一供試品溶液20 μL，分別于0，4，8，12，18，24 h進樣測定。結(jié)果各共有峰相對保留時間和峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 指紋圖譜的建立

2.6.1 樣品測定 按處方量稱取10批藥材，按2.2項下供試品溶液的制備方法進行處理，再按2.1項下色譜條件進樣測定。10批樣品的出峰具有良好的重現(xiàn)性，出峰總數(shù)為23個，確定共有特征峰19個，各批共有峰的峰面積之和占總峰面積的比例均大于95%。

2.6.2 共有峰的歸屬 將10批養(yǎng)精種玉湯供試品與對照藥材及陰性對照溶液的色譜圖進行比較，確定屬白芍的共有峰 7 個，分別為 2、9、11、12、13、14、18 號峰;屬山茱萸的共有峰 8 個，分別為 2、4、5、6、7、8、10、19 號峰;屬當(dāng)歸的共有峰 5個，分別為1、3、10、15、16 號峰;屬熟地黃的共有峰 2 個，分別為3、16號峰。其中2號峰為白芍與山茱萸所共有，3、16號峰為當(dāng)歸與熟地黃所共有;10號峰為山茱萸與當(dāng)歸所共有。各藥材的峰歸屬結(jié)果見圖1～5。

2.6.3 參照峰的選擇 經(jīng)過與對照品溶液及陰性對照溶液的比較，確定10、13、15號峰分別為馬錢苷、芍藥苷和阿魏酸。由于芍藥苷為方中白芍的主要有效成分，且該成分在色譜圖中的保留時間適中，且分離度和穩(wěn)定性均優(yōu)于馬錢苷與阿魏酸，故選擇芍藥苷為參照峰進行計算。各共有峰的相對保留時間與相對峰面積數(shù)據(jù)見表2、表3。

圖1 養(yǎng)精種玉湯供試品HPLC圖

圖2 白芍峰歸屬HPLC圖

圖3 山茱萸峰歸屬HPLC圖

圖4 當(dāng)歸峰歸屬HPLC圖

圖5 熟地黃峰歸屬HPLC圖

2.6.4 相似度計算 指紋圖譜反映的是樣品整體的特征，進行指紋圖譜相似度檢驗，可以反映樣品之間的親疏程度，從而評價所建立指紋圖譜的穩(wěn)定性和可行性。本實驗采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2004 A版)進行相似度計算，時間窗設(shè)定為0.40，生成對照方法為中位數(shù)生成法，結(jié)果相似度達到0.9以上，表明所建立的指紋圖譜具有良好的重現(xiàn)性。10批樣品相似度計算結(jié)果見表4，匹配后的HPLC圖見圖6。

表2 10批樣品共有峰相對保留時間數(shù)據(jù)(以13號峰芍藥苷為參照峰)

表4 10批樣品相似度計算結(jié)果

2.7 質(zhì)量控制指標 根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，規(guī)定質(zhì)量控制具體指標如下:供試品圖譜與對照指紋圖譜比較，其共有峰的相對保留時間差值不得大于±10%;非共有峰總面積不得大于總峰面積的5%;2號峰的峰面積差值不得大于±20%，11號峰差值不得大于±25%，10、12號峰差值不得大于±30%;供試品圖譜與對照指紋圖譜經(jīng)計算機模擬相似度評價軟件計算，相似度不得低于0.9。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 根據(jù)養(yǎng)精種玉湯各藥材所含成分的紫外吸收特征，分別設(shè)定檢測波長為225、240、254、260、280 nm進樣測定，綜合比較色譜峰的數(shù)目、峰形、信號響應(yīng)強弱及基線的平穩(wěn)程度，選定225 nm為測定波長。

3.2 流動相的選擇 實驗中比較了甲醇-水系統(tǒng)和乙腈-水系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明乙腈明顯優(yōu)于甲醇。此外，將流動相的pH值調(diào)至酸性，可改善峰形，且酸的種類對峰形有較大影響。分別采用了甲醇-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)進行比較，最終確定流動相為乙腈-0.1%磷酸水系統(tǒng)，乙腈在5% ～25%范圍內(nèi)梯度洗脫，檢測時間為45 min。

3.3 提取條件的選擇 由于養(yǎng)精種玉湯所含成分類型較多，一種檢測方法或一張圖譜不能反映其固有特性。本研究采用溶劑萃取法，先后采用乙酸乙酯、正丁醇將養(yǎng)精種玉湯水煎液分成不同極性部位，分別進行指紋圖譜分析，并建立相應(yīng)部位的對照指紋圖譜，可起到互相補充、雙重鑒別的效果。本實驗報道其正丁醇部位指紋圖譜的研究結(jié)果。

［1］何高明.傅青主婦科校釋［M］.太原:山西人民出版社，1984:77-79.

［2］劉翠華，劉國勇.加減養(yǎng)精種玉湯對小鼠卵巢LPO的影響［J］. 中醫(yī)藥學(xué)報，1998，26(4):49-50.

［3］谷長任，張 瑋，周健秋，等.養(yǎng)精種玉湯對兔卵巢顆粒細胞孕酮生成的影響及機制［J］.中醫(yī)藥學(xué)報，2002，30(3):55-56.

［4］林 蕓，袁麗萍，郭裕萍.加味養(yǎng)精種玉湯治療月經(jīng)少30例［J］. 實用中醫(yī)藥雜志，2005，21(8):470-471.

［5］屠鵬飛.高效液相法制定中藥材和中藥注射劑特征指紋圖譜的探討［J］. 中成藥，2000，22(7):516.