TNF-α基因多態(tài)性與腸結(jié)核患者胸腺肽-alpha1治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化的相關(guān)性研究

梁旭峰，梁 虹，汪關(guān)寶，矯秀紅(1.北京市中關(guān)村醫(yī)院，北京市 100190;.雞西市人民醫(yī)院，雞西市158100)

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是一種潛在的免疫調(diào)節(jié)劑和重要的炎性細(xì)胞因子，一般出現(xiàn)在炎癥反應(yīng)的早期，具有多種生物學(xué)活性。近年來國外有研究發(fā)現(xiàn)，人群中不同的TNF-α基因型可能決定了不同個體間TNF-α的表達(dá)與功能上的差異，進(jìn)而影響到體內(nèi)TNF-α的最終生物學(xué)效應(yīng)［1］。因此，TNF-α的不同基因型有可能作為重要的基因背景，決定了不同人群對于某些炎癥疾病有著不同的免疫調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步導(dǎo)致了不同的臨床特征。胸腺肽-alpha1是一種人工合成的生物制劑，具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的良好效應(yīng)，近年來在惡性腫瘤、免疫缺陷性疾病，結(jié)核感染等的治療中取得了較好的臨床效果［2］。本研究在傳統(tǒng)抗結(jié)核化療方案基礎(chǔ)上加用胸腺肽-alpha1治療腸結(jié)核(intestinal tuberculosis)患者，并探討 TNF-α基因多態(tài)性對腸結(jié)核患者胸腺肽-alpha1治療前后T淋巴細(xì)胞亞群變化的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

研究病例均為2006年6月—2009年6月在中關(guān)村醫(yī)院(29例)與雞西人民醫(yī)院(37例)門診或住院就診的患者?？傆?6例，治療方案為:抗結(jié)核 +胸腺肽 -alpha1治療，其中男31例，女35例，年齡27～63歲，平均年齡(42.82±6.74)歲。試驗方案經(jīng)北京市中關(guān)村醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)。在簽署知情同意書后，收集患者年齡、性別等人口學(xué)資料、臨床資料及實驗室檢查資料。所有病例臨床資料完整，研究人群均系中國漢族人群，個體之間均無血緣關(guān)系。診斷標(biāo)準(zhǔn):腸結(jié)核診斷根據(jù)其病史、臨床表現(xiàn)、PPD試驗、內(nèi)鏡、X線影像、病理改變、抗酸染色而確診。所有患者的診斷應(yīng)必須至少滿足下列一個或更多的條件:消化道內(nèi)鏡明確的干酪性肉芽腫;涂片或組織切片示抗酸桿菌陽性;源自組織標(biāo)本中的抗酸桿菌培養(yǎng)陽性;腸鏡結(jié)果強(qiáng)烈提示典型腸結(jié)核結(jié)并同時合并有活動性肺結(jié)核。納入標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)以上診斷標(biāo)準(zhǔn)納入的研究對象均排除有免疫相關(guān)或免疫性疾病、克羅恩病、肉芽腫性炎癥、潰瘍性結(jié)腸炎、腸道腫瘤，以及心、肝、腎等基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn):試驗開始前已開始抗結(jié)核治療或治療超過1周、近12周內(nèi)使用過免疫調(diào)節(jié)藥物(免疫增強(qiáng)或抑制劑)、以及血液標(biāo)本采集前有輸全血或其他成分輸血記錄的患者均剔除本研究。

1.2 藥品、試劑、儀器、給藥方法

藥品:胸腺肽-alpha1，商品名:日達(dá)仙，美國賽生藥品股份公司生產(chǎn)，批號0292A，每支劑量規(guī)格為1.6 mg。試劑、儀器:檢測儀器使用流式細(xì)胞分選儀，型號為 FACSCalibur，由美國Becton Dickinson(BD)公司生產(chǎn)，試劑盒由同一公司提供。離心機(jī)為法國JUNAN公司生產(chǎn)，型號為CR422。所有腸結(jié)核患者于治療前1天(T0w)、治療第16周結(jié)束(T16w)清晨抽取空腹靜脈血3 ml，置EDTA抗凝管，高速離心取上清液，后置-800C中保存待測;T淋巴細(xì)胞亞群及 NK細(xì)胞檢測使用FACSCalibur流式細(xì)胞儀及BD公司提供 perCP標(biāo)記的抗CD3+、FITC標(biāo)記的抗 CD4+、和 PE標(biāo)記的抗 CD8+單克隆抗體進(jìn)行染色，檢測 CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞以及 NK細(xì)胞(CD16+CD56+)的百分?jǐn)?shù)與CD4+/CD8+比值;流式細(xì)胞分選儀內(nèi)部分析模塊自動對結(jié)果進(jìn)行定量分析。給藥方法:所有患者根據(jù)各自病情先給予補(bǔ)液、糾正水及電解質(zhì)酸堿平衡紊亂、胃腸減壓、解痙、抗感染以及抗結(jié)核等基礎(chǔ)治療;抗結(jié)核治療方案采用聯(lián)合化療，療程為12個月，即前3個月采用異煙肼(INH 0.3 g，qd，po)、利福平(RFP 0.45 g，qd，po)、乙胺丁醇(EMB 0.75 g，qd，po)、吡嗪酰胺(PZA 1.0 g，qd，po)四聯(lián)治療，以后序貫9個月的等劑量 INH、RFP維持治療;同時加強(qiáng)全胃腸外營養(yǎng)(total parenteral nutrition，TPN)治療，采用葡萄糖、脂肪乳雙重能量系統(tǒng)，每日提供168～210 kJ·kg-1。左右的熱量，盡可能維持正氮平衡。同時給予胸腺肽 -alpha1皮下注射1.6 mg，每周2次，療程總計使用16周。

1.3 藥品不良反應(yīng)觀察

治療期間，每次隨訪時均詢問患者有無不適反應(yīng)，包括局部刺激癥狀;并做常規(guī)體檢;用藥期間及用藥結(jié)束3周后，觀察患者血、尿常規(guī)，肝、腎功能的變化，如有異常則即給予對癥處理。

1.4 基因組DNA提取

采集靜脈全血2 mL，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，常規(guī)蛋白酶K消化后苯酚/氯仿提取基因組DNA，總共提取腸結(jié)核患者外周血DNA 66例，提取的DNA溶解于 TE中，-80℃冰箱保存。

1.5 多態(tài)性位點(diǎn)的選擇及引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)選擇TNF-α基因啟動子區(qū)的兩個 SNP位點(diǎn):-238G/A、-308G/A，每個多態(tài)性位點(diǎn)的詳細(xì)資料見表1。在Gene Bank中檢索到 TNF-α基因的全長序列，利用Generunner3.05(http://www.generunner.net/)軟件，設(shè)計針對TNF-α中每個位點(diǎn)的 PCR擴(kuò)增引物，引物由上海申友生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 TNF-α基因啟動子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的確認(rèn)及引物設(shè)計Tab 1 Confirmation of TNF-α gene promoter polymorphisms and primer design

1.6 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件程序

PCR擴(kuò)增體系及程序如下:ddH2O 40.5 μL，10×PCR緩沖液(含 1.5 mmol·L-1Mg2+)5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，Taq 酶 5 U(Promega Company，USA)，上、下游引物各 1 μL(20 μmol·L-1)，DNA 模板 1 μL(500 ng)。PCR 擴(kuò)增采用程序:94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s→退火40 s，溫度依次為59.0℃(TNFα -238)、52.5℃(TNFα -308)→72 ℃ 延伸 40 s，共30個循環(huán)，最后在72℃條件下延伸10 min(PE Biosystems，USA)，PCR產(chǎn)物采用 Multiscreen-PCR純化板(Millipore Company，USA)進(jìn)行純化。

1.7 RFLP判斷病例組TNF-α基因型

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，分別采用限制性內(nèi)切酶Msp I和Nco I(New England Biolabs Beverly，Ma，USA)對 TNF-α-238G/A、-308G/A兩個位點(diǎn)進(jìn)行酶切基因分型。每個反應(yīng)體系為20 μL，其中 DNA 約 1 μg、內(nèi)切酶 5 U、加各自內(nèi)切酶相應(yīng)的10 ×Buffer 2 μL、最后加 ddH2O 至 20 μL，在 37 ℃ 下水浴 8 h。酶切完成后進(jìn)行瓊脂糖(2%)電泳(Agarose-1000;Gibco BRL，Rockville，MD，USA)，根據(jù)電泳條帶數(shù)判斷每一個體TNF-α多態(tài)性位點(diǎn)的基因型。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

以 Chi-square Test檢驗驗證 TNF-α -238、-308基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律;采用兩樣本均數(shù)的t檢驗分析處理在不同多態(tài)性的情況下，T淋巴細(xì)胞亞群及NK細(xì)胞的變化差異。所有統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義，統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS11.5軟件。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的基本資料

在本課題中腸結(jié)核患者的臨床基線資料大致情況為:腹痛48例、腹瀉34例、體重減輕29例以及發(fā)熱14例;實驗室檢查的基線資料:貧血12例、白細(xì)胞計數(shù)增多19例、低蛋白血癥3例、ESR(erythrocyte sedimentation rat)增高42例及 CRP(C-reactive protein)增高29例;腸結(jié)核病變侵犯部位統(tǒng)計:回盲部51例、升結(jié)腸29例、橫結(jié)腸15例、降結(jié)腸5例、乙狀結(jié)腸3例、直腸2例;出現(xiàn)腸腔狹窄:13例。

2.2 TNF-α啟動子區(qū)基因多態(tài)性 PCR-RFLP電泳分析結(jié)果

66例腸結(jié)核患者中，TNF-α啟動子中-238GG基因型為48例(72.73%)、-238GA基因型為 17例(25.76%)、-238AA基因型為1例(1.51%);TNF-α啟動子中 -308G/G基因型為 51例(77.27%)、-308GA基因型為 15例(22.73%)，所研究患者中未發(fā)現(xiàn) TNF-α啟動子中 -308 AA突變純合子個體。兩個多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，經(jīng)檢驗P＞0.05，等位基因的頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.3 胸腺肽-alpha1治療前后免疫學(xué)指標(biāo)的比較

66例患者在常規(guī)抗結(jié)核治療基礎(chǔ)上加用胸腺肽-alpha1治療后，統(tǒng)計結(jié)果顯示(表2):在治療16周結(jié)束時的統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:TNF-α-308 GA+AA基因型組合的患者中CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等檢測值均較治療前明顯增高，均具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);而TNF-α-308 GG野生型基因組合的患者在本實驗的第16周觀察終點(diǎn)，以上實驗室檢測值盡管略有不同，但統(tǒng)計分析結(jié)果顯示無顯著性差異(P＞0.05)。同樣，TNF-α-238多態(tài)性位點(diǎn)野生型GG以及多態(tài)性GA的腸結(jié)核患者，在本實驗的16周治療終點(diǎn)的統(tǒng)計分析中，CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等檢測值均未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

表2TNF-α基因多態(tài)性在胸腺肽-alpha1治療前后免疫指標(biāo)的比較(±s)Tab 2 Immune parameters of polymorphisms of TNF- α gene before and after the treatment with thymosin-alpha 1(±s)

表2TNF-α基因多態(tài)性在胸腺肽-alpha1治療前后免疫指標(biāo)的比較(±s)Tab 2 Immune parameters of polymorphisms of TNF- α gene before and after the treatment with thymosin-alpha 1(±s)

項目 變量 CD3+/% CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+ NK 24.50±3.13 T16w 59.05±9.54 52.16±8.35 27.54±6.59 1.78±0.14 24.15±4.46 P value 0.38 0.27 0.11 0.08 0.62 TNF-α-238 GA+AA T0w 57.05±7.28 56.92±7.22 26.26±4.85 1.66±0.56 28.66±5.16 T16w 58.58±7.03 55.85±9.36 27.05±5.32 1.72±0.48 27.90±4.86 P value 0.19 0.36 0.24 0.13 0.09 TNF-α-308 GG T0w 56.56±6.81 56.68±7.08 25.92±6.98 1.63±0.37 27.96±5.98 T16w 57.89±8.96 57.02±8.74 25.26±4.85 1.76±0.26 28.11±4.18 P value 0.71 0.56 0.90 0.06 0.45 TNF-α-308 GA+AA T0w 59.60±6.92 55.89±5.89 25.06±4.65 1.46±0.85 25.09±5.60 T16w 67.89±8.80 59.98±6.45 28.69±5.98 1.89±0.90 28.36±3.89 P細(xì)胞TNF-α-238 GG T0w 58.53±7.31 51.59±9.92 26.93±5.45 1.69±0.53 value ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 0.02 ＜0.01

2.4 不良反應(yīng)

在本實驗的66例患者中，有1例患者應(yīng)用胸腺肽-alpha1治療后軀干部出現(xiàn)散在的細(xì)小紅色丘疹，給予抗過敏藥物口服治療后消失;有2例患者在應(yīng)用胸腺肽 -alpha1治療后其AST較治療前有所增高，未超過2×ULN(upper limits of normal)，但不能排除為抗結(jié)核藥物治療所致，經(jīng)保肝治療后AST恢復(fù)正常。

3 討論

TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和內(nèi)皮細(xì)胞分泌產(chǎn)生的具有多種生物活性的多肽調(diào)節(jié)因子，在機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。通常在人體內(nèi)，TNF-α是由處于靜止?fàn)顟B(tài)下的巨噬細(xì)胞在內(nèi)源性干擾素、細(xì)菌及其內(nèi)毒素、病毒等刺激下被活化后產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，能夠與白細(xì)胞介素-1等細(xì)胞因子相互誘生，從而激發(fā)炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)。作為重要的內(nèi)源性細(xì)胞因子，TNF-α具有廣泛的生物學(xué)功能，適量濃度的TNF-α在體內(nèi)具有抗感染免疫作用，有利于病原體及其產(chǎn)物的清除［3］。人類 TNF-α基因位于染色體6p21.3區(qū)域，在TNF-α啟動子區(qū)域內(nèi)，Kroeger等［4］研究了 TNF-α-308G/A多態(tài)性對TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響，發(fā)現(xiàn)含有TNF-α A等位基因的重組體轉(zhuǎn)錄水平比含TNF-α G等位基因的重組體高兩倍。另外，在關(guān)于TNF-α表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究中發(fā)現(xiàn)，一段長10 bp的含有TNF-α基因-308位點(diǎn)的DNA片段可能是轉(zhuǎn)錄因子AP-2的識別序列，當(dāng)-308位點(diǎn)是G等位基因時，AP-2可以識別該序列并與之結(jié)合，若發(fā)生 G→A替換，AP-2無法識別該序列，因此TNF-α基因啟動子區(qū)多態(tài)性可能通過影響其下游TNF-α的表達(dá)產(chǎn)量，與個體對感染性疾病的易感性、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)［5］。

胸腺肽-alpha1是人胸腺素中純化出來的一種生物因子，是由28個氨基酸組成的小分子多肽，具有促進(jìn)體內(nèi)細(xì)胞因子的分泌以及增強(qiáng)淋巴細(xì)胞功能的作用，也是一種細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑［6］。在本試驗中，66例腸結(jié)核患者在常規(guī)抗結(jié)核治療基礎(chǔ)上加用胸腺肽 -alpha1治療后，統(tǒng)計結(jié)果顯示在本實驗第16周治療結(jié)束時，TNF-α-308 GA+AA基因型組合的患者中 CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK cells等檢測值均較治療前明顯增高，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);而TNF-α-308 GG野生型基因組合的患者以及 TNF-α-238多態(tài)性位點(diǎn)野生型GG、多態(tài)性GA的腸結(jié)核患者，盡管在本實驗中的檢測值略有不同，但統(tǒng)計分析結(jié)果顯示無顯著性差異(P＞0.05)。因此本實驗結(jié)果表明TNF-α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)性，可能與胸腺肽-alpha1治療后機(jī)體T淋巴細(xì)胞的改變有著密切的關(guān)聯(lián);該結(jié)果提示我們在腸結(jié)核的治療中，TNF-α-308位點(diǎn)的基因多態(tài)性對于腸結(jié)核患者的免疫輔助治療，可能有著一定的篩選依據(jù)作用。

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