復(fù)方丹參片質(zhì)量對(duì)其耐缺氧和抗心肌缺血作用的影響Δ

劉明華，楊曉靜，劉田云，陳慧慧，孫付軍，劉逢芹#(.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，濟(jì)南市 5055;.山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院，濟(jì)南市 5004;.山東省中醫(yī)藥研究院，濟(jì)南市 5004)

近年來復(fù)方丹參片配伍的藥理研究較多［1］，認(rèn)為相關(guān)藥效成分單用時(shí)基因表達(dá)模式是弱效應(yīng)的有機(jī)整合，而配伍作用模式則是多途徑、多效應(yīng)的綜合調(diào)節(jié)。常躍興等［2］對(duì)我國市場流通的復(fù)方丹參片產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)表明不同廠家的產(chǎn)品差異較大，部分藥效成分的含量相差數(shù)倍甚至幾十倍，含量差異可能對(duì)藥物臨床療效的發(fā)揮產(chǎn)生一定影響，為此我們按綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)情況選擇3個(gè)生產(chǎn)廠家的產(chǎn)品進(jìn)行藥學(xué)和藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)比較。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

動(dòng)物為昆明種小鼠，(20±2)g，雌雄各半;Wistar大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給，合格證號(hào):SCXK(魯)20090001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

復(fù)方丹參片:隨機(jī)購買于不同的醫(yī)療機(jī)構(gòu)，隱去企業(yè)名稱，編號(hào)為1、2、3號(hào);垂體后葉素:上海禾豐藥業(yè)有限公司產(chǎn)品(批號(hào):080101);冰片對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)743-8902);丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110766-200417);丹酚酸B對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)111562-200605，含量98.5%)。

1.3 試劑

甲醇、乙腈為色譜純;實(shí)驗(yàn)用水為純凈水;乙酸乙酯、乙醚、苯、硫酸均為分析純。

1.4 儀器

Waters600高效液相色譜儀，Waters2487紫外檢測器，Empower色譜工作站;BP211D型十萬分之一分析天平(賽多利斯儀器有限公司);KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn));XD-7100單道心電圖機(jī)(上海醫(yī)療器械高技術(shù)公司生產(chǎn));202型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(山東濰坊精鷹醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn));0.45 μm微孔濾膜(上海市新亞凈化器件廠生產(chǎn))。

2 方法與結(jié)果

2.1 藥品質(zhì)量評(píng)價(jià)

依照《中華人民共和國藥典》(2005年版)標(biāo)準(zhǔn)中復(fù)方丹參片項(xiàng)下要求操作，分別對(duì)各供試品進(jìn)行藥品質(zhì)量檢測。

2.1.1 崩解時(shí)間比較:取各供試品各6片，按照《中華人民共和國藥典》附錄Ⅻ A崩解時(shí)限檢查法項(xiàng)下操作，進(jìn)行崩解時(shí)間檢查，記錄各供試品的崩解時(shí)間，求其平均值，結(jié)果見表1。

2.1.2 冰片鑒別:取各供試品各5片，研細(xì)加入乙醚10 mL，超聲處理5 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL溶解，作為供試品溶液;取冰片對(duì)照品適量，加乙酸乙酯制得對(duì)照品溶液。取各供試溶液在硅膠 G薄層板上依次點(diǎn)樣5 μL，以苯-乙酸乙酯(40∶1)展開，取出，噴以硫酸香草醛溶液，于110℃下烘至斑點(diǎn)顯色清晰，各供試樣品中冰片成分比較見圖1。

采用TLC法對(duì)復(fù)方丹參片成分冰片的相對(duì)含量差異進(jìn)行了比較，其中1號(hào)斑點(diǎn)顏色較深，2號(hào)和3號(hào)冰片斑點(diǎn)差異不大。

2.1.3 丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量測定:按照標(biāo)準(zhǔn)操作，精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品，加甲醇溶解配制成每 mL含40 μg的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液;精密稱取丹酚酸B對(duì)照品，加水溶解配制成每mL含80 μg的丹酚酸B對(duì)照品溶液。分別取各供試樣品10片，研細(xì)，各精密稱取約1 g，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理 15 min，放冷稱重，用甲醇補(bǔ)足重量，微孔濾膜濾過制得丹參酮ⅡA供試品溶液;再取各研細(xì)的粉末約0.15 g，精密稱定，精密加入水50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷用水補(bǔ)足減失的重量，取上清液微孔濾膜濾過，制得丹酚酸B供試品溶液。

HPLC色譜條件:迪馬公司 DiamonsilTM C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇 - 水(85∶15，V/V)為流動(dòng)相，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為270 nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量為20 μL，測定丹參酮ⅡA含量;以乙腈 -甲醇 -甲酸 -水(10∶31∶1∶58，V/V)為流動(dòng)相，檢測波長 286 nm，其他條件同上，測定丹酚酸 B含量。HPLC圖譜見圖2、圖3，結(jié)果見表1。

3個(gè)廠家復(fù)方丹參片所含藥效成分冰片、丹參酮ⅡA、丹酚酸B含量存在較大差異。

圖1 復(fù)方丹參片冰片TLC圖Fig 1 TLC of borneol of Compound Danshen Tablets

2.2 藥效學(xué)方法與結(jié)果

2.2.1 供試溶液的配制:取各供試樣品各6片，分別編號(hào)為1、2、3組，研細(xì)，加水分別配成100 mL 0.9%氯化鈉注射液的混懸溶液，作為小鼠灌胃用藥物供試液;取各供試品各9片，分別編號(hào)為1、2、3組，研為細(xì)粉，加水分別配成100 mL 0.9%氯化鈉注射液的混懸溶液，作為大鼠灌胃用藥物供試溶液;取垂體后葉素注射液，加0.9%氯化鈉注射液配成1 U·mL-1的溶液，作為急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ驮炷Ｓ盟幬铩?/p>

圖2 復(fù)方丹參片中丹參酮ⅡA的HPLC圖譜Fig 2 HPLC of tanshinoneⅡAin Compound Danshen Tablets

圖3 復(fù)方丹參片中丹酚酸B的HPLC圖譜Fig 3 HPLC of salvianolic acid B of Compound Danshen Tablets

表1 復(fù)方丹參片藥品質(zhì)量指標(biāo)Tab 1 Pharmaceutical quality index of Compound Danshen Tablets

2.2.2 對(duì)小鼠常壓耐缺氧時(shí)間的影響:20～22 g昆明種小鼠，48只，♀♂各半，按體重性別均衡分為復(fù)方丹參片1、2、3號(hào)給藥組和空白對(duì)照組，每組12只，雄雌各6只。分組后按照組別分別灌胃給予相應(yīng)供試品20 mL·kg-1，空白對(duì)照組給予同體積水灌胃。1次性給藥60 min后，將小鼠按給藥順序逐一放入150 mL廣口瓶(內(nèi)置20 g鈉石灰)中，同時(shí)密閉廣口瓶，記錄封閉瓶口至小鼠呼吸停止時(shí)間，即常壓耐缺氧時(shí)間，計(jì)算各組缺氧時(shí)間的均數(shù)，結(jié)果見表2。

表2 不同質(zhì)量復(fù)方丹參片對(duì)小鼠常壓耐缺氧時(shí)間的影響(±s，n=12)Tab 2 Effects of different quality of compound Danshen Tables on normobaric hypoxia tolerance time of mice(±s，n=12)

表2 不同質(zhì)量復(fù)方丹參片對(duì)小鼠常壓耐缺氧時(shí)間的影響(±s，n=12)Tab 2 Effects of different quality of compound Danshen Tables on normobaric hypoxia tolerance time of mice(±s，n=12)

注:與空白組變化值比較，*P＜0.05。note:vs.blank group，*P ＜0.05

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記錄每只小鼠的缺氧死亡時(shí)間，計(jì)算各組缺氧時(shí)間的均數(shù)，結(jié)果可見空白組耐缺氧時(shí)間較其它各組均稍低，提示復(fù)方丹參片給藥后能延長小鼠缺氧的存活時(shí)間，其中1組延長時(shí)間較為明顯(P ＜0.05)。

2.2.3 對(duì)大鼠急性心肌缺血的影響:200～250 g Wistar大鼠40只，♀♂各半，按性別、體重均衡隨機(jī)分為1、2、3號(hào)組和對(duì)照。按照組別分別灌胃給予相應(yīng)供試品溶液10 mL·kg-1，連續(xù)給藥3 d，第4 d給藥90 min后，參照垂體后葉素致大鼠心肌缺血法［3］操作，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物仰臥位固定，針型電極插入四肢皮下，心電圖機(jī)的靈敏度調(diào)至1 mV=2 mm，速度為50 mm·s-1，記錄給藥前正常心電圖，股靜脈快速注射垂體后葉素1.0 U·kg-1體重，于注射后即刻、第 10 s、30 s、1 min、4 min、7 min、10 min各記錄心電圖1次，觀察大鼠心率、S-T段、T波的變化，結(jié)果見表3、表4、表5。其影響趨勢(shì)及變化見圖4、圖5、圖6。

表3 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血心率的影響(±s，n=10)Tab 3 Effects of different quality of compound Danshen Tables on heart rates of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=12)

表3 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血心率的影響(±s，n=10)Tab 3 Effects of different quality of compound Danshen Tables on heart rates of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=12)

注:與空白組變化值比較，*P＜0.05note:vs.blank group，*P ＜0.05

組別 劑量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 - 485.54±41.01 439.73±114.86 266.57±169.84 196.83±67.99 233.05±72.96 334.31±65.68 308注射前/次/min注射垂體后葉素后即刻332.83±98.16 375.36±123.82.08±89.09 361.34±76.18 1組 0.81 477.12±43.54 456.19±42.36 432.75±97.52 246.52±127.46 251.96±45.09 386.04±58.58 369.48±40.77 398.81±35.29 2組 0.81 501.83±47.03 474.41±67.15 410.02±101.54 209.03±96.47 242.84±115.16 391.99±56.07 397.19±65.25 415.16±60.10 3組 0.81 483.92±49.44 449.75±58.72 369.39±115.69 183.37±95.32 236.87±108.95 360.52±43.61

表4 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血S-T段的影響(±s，n=10)Tab 4 Effects of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

表4 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血S-T段的影響(±s，n=10)Tab 4 Effects of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

注:與空白組變化值比較，*P＜0.05note:vs.blank group，*P ＜0.05

組別劑量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 — 0.60±0.305 1.52±1.321 0.24±0.23 0.19±0.36 0注射前/次/min注射垂體后葉素后即刻.29±0.52 0.96±0.75 0.86±0.61 1.11±0.35 1組 0.81 0.65±0.478 1.38±1.319 0.87±0.55 0.39±0.33 0.73±0.29 1.12±0.25 1.16±0.38 1.20±0.32 2組 0.81 0.66±0.23 1.65±1.070 0.89±1.05 0.29±0.54 0.57±0.35 1.02±0.41 1.23±0.26 1.17±0.36 3組 0.81 0.71±0.31 1.60±1.261 1.15±0.72 0.21±0.70 0.34±0.38 1.45±1.11 1.40±0.87 1.07±0.32

心率:空白組大鼠心率即刻即出現(xiàn)心律的降低和心率不齊，與注射前比較心率下降45次/min，出現(xiàn)較為嚴(yán)重的心律不齊(表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)差的增加)，注射后即刻至60 s時(shí)心率變化較為明顯，60 s以后逐漸恢復(fù)，至 4 min時(shí)心率恢復(fù)至 334次/min，7 min時(shí)心率與4 min時(shí)變化不明顯，10 min時(shí)心率上升至361次/min，較注射前下降了116次/min。與空白組比較3組實(shí)驗(yàn)組對(duì)大鼠心率均有不同程度的改變，即刻心率降低程度明顯低于空白組，且各組心率標(biāo)準(zhǔn)差明顯小于空白組，提示給予復(fù)方丹參片可以明顯改善心肌缺血對(duì)心率和心律的影響，其中1組作用優(yōu)于2、3組，10 s和30 s時(shí)心率的變化趨勢(shì)同即刻心率一致，60 s～10 min內(nèi)心率的變化不同程度保持此變化趨勢(shì)，10 min時(shí)1、2組仍明顯優(yōu)于空白組，且標(biāo)準(zhǔn)差較小。

心電圖S-T段:空白組大鼠S-T段10 s至30 s時(shí)降低，隨后呈現(xiàn)抬高趨勢(shì)，4～10 min時(shí)間內(nèi)抬高的程度無明顯變化。觀察整個(gè)S-T段的變化，空白組大鼠給藥后S-T段瞬間抬高即出現(xiàn)病理缺血性降低，于1 min左右即開始恢復(fù)性抬高。各給藥組對(duì)S-T段的影響基本與空白組的變化趨勢(shì)一致，但S-T段的改變程度較空白組小，其中1號(hào)組較其他兩組明顯。

心電圖T波:空白對(duì)照組大鼠T波幅度10～60 s時(shí)壓低，隨后逐漸改善，4～10 min時(shí)間內(nèi)T波的變化不明顯。各給藥組對(duì)T波的影響基本與空白組的變化趨勢(shì)一致，但T波改變程度較空白組小，其中1號(hào)組較其他兩組明顯。

表5 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血T波的影響(±s，n=10)Tab 5 Effects of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

表5 復(fù)方丹參片對(duì)垂體后葉素致Wistar大鼠急性心肌缺血T波的影響(±s，n=10)Tab 5 Effects of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with pituitrin-induced acute myocardial ischemia(±s，n=10)

注:與空白組變化值比較，*P＜0.05。note:vs.blank group，*P ＜0.05

組別劑量/片/kg 10 s 30 s 60 s 4 min 7 min 10 min空白 — 1.78±0.33 2.94±1.59 1.38±0.23 1.05±0.43 1.0注射前/次/min注射垂體后葉素后即刻0±0.76 2.01±1.30 2.06±1.14 1.81±0.34 1組 0.81 1.89±0.53 2.51±1.63 1.91±0.83 1.21±0.68 1.60±0.94 1.91±0.50 2.04±0.52 2.05±0.55 2組 0.81 1.93±0.46 2.82±1.22 1.89±1.25 0.95±0.61 1.32±0.59 1.71±0.79 1.87±0.41 1.96±0.37 3組 0.81 1.88±0.45 2.47±1.68 2.09±1.18 1.12±0.39 1.37±0.30 2.40±0.96 2.17±0.61 2.06±0.57

圖4 復(fù)方丹參片對(duì)心肌缺血大鼠心率的影響Fig 4 Effects of Compound Danshen Tables on heart rates of rats with myocardial ischemia

圖5 對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖S-T的影響趨勢(shì)Fig 5 Effect tendency of Compound Danshen Tables on S-T segment of Wistar rats with acute myocardial ischemia

圖6 對(duì)急性心肌缺血大鼠心電圖T波的影響趨勢(shì)Fig 6 Effect tendency of Compound Danshen Tables on T wave of Wistar rats with acute myocardial ischemia

4 討論

通過對(duì)3個(gè)供試品的綜合質(zhì)量指標(biāo)評(píng)價(jià)，證實(shí)不同廠家生產(chǎn)的產(chǎn)品間差異明顯，藥品中所含比較明確的有效成分含量差異較大，含量大小為1＞2＞3。為了驗(yàn)證藥學(xué)質(zhì)量的差別是否會(huì)導(dǎo)致其臨床療效不同，我們從藥效學(xué)角度對(duì)其進(jìn)行了耐缺氧和改善心肌缺血功能方面的對(duì)比研究。

垂體后葉素廣泛用于急性心肌缺血的造模，是一種簡單而穩(wěn)定的造模方法［4，5］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用垂體后葉素靜脈注射建立大鼠急性心肌缺血模型，觀察心電圖ST段和T段變化，以比較3個(gè)供試品對(duì)急性心肌缺血的保護(hù)作用。

通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究觀察，提示3個(gè)不同廠家的復(fù)方丹參片對(duì)上述兩實(shí)驗(yàn)存在不同程度的影響。3種復(fù)方丹參片均不同程度延長小鼠常壓耐缺氧時(shí)間，其中1號(hào)廠家的產(chǎn)品與空白對(duì)照組比較有顯著性差異(P＜0.05);對(duì)垂體后葉素誘導(dǎo)的缺血性心律失常有明顯的保護(hù)作用，對(duì)心肌缺血心電圖的ST段及T段改變也具有一定的改善作用。所得數(shù)據(jù)由于標(biāo)準(zhǔn)差較大，影響均數(shù)統(tǒng)計(jì)，所以數(shù)據(jù)通過T檢驗(yàn)處理未有理想的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從直觀結(jié)果上可以明顯看出藥品質(zhì)量對(duì)療效的影響，復(fù)方丹參片抗心肌缺血作用與所含的化學(xué)成分含量呈正相關(guān)趨勢(shì)，產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量與藥效發(fā)揮有著直接的關(guān)聯(lián)，我國市場上的復(fù)方丹參片內(nèi)在質(zhì)量有待進(jìn)一步整頓和提高。

［1］ 張 萌.丹酚酸B/三七總皂苷配伍對(duì)心肌梗死大鼠的影響及抑制心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究［D］.天津中醫(yī)學(xué)院博士論文，2005，26(3):140.

［2］ 常躍興，劉田云，劉逢芹.不同廠家復(fù)方丹參片丹參酮ⅡA和丹酚酸 B 含量比較［J］.中藥材，2009，32(11):1771.

［3］ 葉春玲，呂艷青，楊延秀，等.護(hù)心靈對(duì)垂體后葉素所致的大鼠急性心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中成藥，2001，3(1):813.

［4］ 陳 奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:523.

［5］ 徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003:1009-1017.