RP-HPLC法測定鹽酸青藤堿PLGA納米粒的包封率及載藥量

侯鵬偉，王 東，范 嬌，于 輝，彭海生，孫守麗(1.黑龍江省食品藥品檢驗(yàn)檢測所，哈爾濱市

150012;2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)大慶校區(qū)藥學(xué)系，大慶市 163319;3，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系，哈爾濱市 150081)

青藤堿是一種從防己科植物青風(fēng)藤中提取出來的一種生物堿單體化合物［1］，一般用其鹽酸鹽。其原植物青風(fēng)藤被用來治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已超過一千年，通過藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)青藤堿具有抗炎、抗風(fēng)濕［2］、免疫抑制［3，4］、以及抗心律失常［5］的作用。但鹽酸青藤堿對光熱不穩(wěn)定，易分解，生物半衰期較短，且有致皮疹等不良反應(yīng)［6］。納米粒載藥能降低藥物的副作用，起到緩釋控釋的作用。我們采用乳化-溶劑揮發(fā)法，以聚合物PLGA為載體材料，制備鹽酸青藤堿納米載藥顆粒［7］，為評價(jià)顆粒的質(zhì)量，我們建立了簡便快速、準(zhǔn)確可靠的 RPHPLC分析方法，為評價(jià)該顆粒的包封率和載藥量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀及SPD-20A紫外檢測器(shimadzu，Japan)，LC-SOLUTION 色譜工作站 (shimadzu，Japan)，F(xiàn)A25高速剪切乳化機(jī)(弗魯克，上海)，鹽酸青藤堿(批號MRHTG090513)(陜西森弗生物技術(shù)有限公司)，PLGA(50/50，30000)(山東省醫(yī)療器械工業(yè)研究所)HPLC級甲醇(DIKMA，USA)，HPLC級磷酸二氫鈉二水合物(產(chǎn)品編號CAEQ-4-012929-0100)(CNW，German)，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 納米粒的制備

采用乳化-溶劑揮發(fā)法制備鹽酸青藤堿納米粒，首先將內(nèi)水相(W1相，含有一定量的鹽酸青藤堿的水溶液)在攪拌狀態(tài)下(轉(zhuǎn)速8 000 r·min-1)滴加到含有一定量 PLGA的二氯甲烷中(O相，1%span-80)，形成初乳。再將所得初乳于攪拌狀態(tài)下加入外水相(W2相，含有一定量的 PVA和 tween-80)，轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1，形成復(fù)乳。揮發(fā)復(fù)乳中的有機(jī)溶劑，離心洗滌，冷凍干燥。保留上清液待分析［7］

2.2 溶液的制備

精密稱取鹽酸青藤堿適量，加水制成2.59 mg·mL-1的鹽酸青藤堿儲備液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 波長選擇:精密量取鹽酸青藤堿儲備液適量，加水稀釋至25.9 μg·mL-1，在200～300 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在262 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道［8，9］一致，因此波長選擇為262 nm。

2.3.2 色譜條件:色譜柱:shim-pack VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -10 mmol·L-1NaH2PO4(38∶62);柱溫為30℃;流速為1 mL·min-1;檢測波長為262 nm;進(jìn)樣量為 10 μL。色譜圖見圖 1、2、3。

圖1 陰性對照Fig 1 Negative control

圖2 對照品溶液Fig 2 Control solution

圖3 供試品溶液Fig 3 Sample solution

2.3.3 線性關(guān)系考察:分別精密量取鹽酸青藤堿儲備液適量，稀釋至濃度為 0.51、5.18、12.95、25.90、51.80 μg·mL-1系列溶液。進(jìn)樣量為10 μL，各濃度平行進(jìn)針五針。以濃度(x)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，回歸，得回歸方程:y=8 890.6x+2 144.1，R2=0.999 9，線性范圍為 0.5 ～50 μg·mL-1。

2.3.4 檢測限及定量限試驗(yàn):配制一定濃度的鹽酸青藤堿溶液，依次稀釋，信噪比為3∶1時(shí)的濃度為檢測限，信噪比為10∶1時(shí)的濃度為定量限。結(jié)果:檢測限為 18 ng·mL-1，定量限為 50 ng·mL-1。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn):精密稱取取鹽酸青藤堿適量，稀釋至濃度為 20.36 μg·mL-1，分別在 0、2、4、6、8、10 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL，各進(jìn)五針，計(jì)算得峰面積 RSD=0.79%。

2.3.6 精密度試驗(yàn):精密稱取鹽酸青藤堿15.6 mg，加水溶解并稀釋至15.6 μg·mL-1，1日內(nèi)進(jìn)樣5次，連續(xù)3天，將所得峰面積代入回歸方程計(jì)算其濃度，結(jié)果日內(nèi)精密度和日間精密度分別為RSD=1.31%，RSD=1.59%。

2.3.7 回收率試驗(yàn):按處方比例加入各種輔料進(jìn)行混合，再分別加入鹽酸青藤堿適量，配成 46.20、32.01、18.50 μg·mL-1高中低3個(gè)濃度3個(gè)樣品進(jìn)行測定，各濃度各進(jìn)5針，所得峰面積代入方程計(jì)算其濃度分別為 45.16、31.05、18.01 μg·mL-1，回收率分別為97.74%、97.35%、97.00%，平均回收率為97.37%，RSD=0.38%。

2.4 包封率及載藥量的測定

將制備納米粒過程中所得上清液測量其體積V，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，過濾，再進(jìn)樣，所得峰面積代入回歸方程，計(jì)算得上清液濃度C。再利用下述公式計(jì)算其包封率(entrapment efficiency，EE)和載藥量(drug loading，DL)。EE=(M1-C·V)/M1;DL=(M1-C·V)/［(M1-C·V)+M2］。M1為制備納米粒時(shí)加入青藤堿的質(zhì)量，C為上清液的濃度，V為上清液的體積，M2為制備納米粒時(shí)加入PLGA的質(zhì)量。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了鹽酸青藤堿納米粒的RP-HPLC分析方法，此方法溶劑和輔料對藥物的測定無干擾，鹽酸青藤堿在10 h內(nèi)穩(wěn)定，能準(zhǔn)確快速的對其包封率和載藥量進(jìn)行分析。

在實(shí)驗(yàn)中曾嘗試過以甲醇 -5 mmol·L-1Na2HPO4(55∶45)［10］，乙腈 -0.78%NaH2PO4(12∶88)［11］為流動(dòng)相進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)前者呈弱堿性，超過所用色譜柱適應(yīng)的 pH范圍(2～7.5)，使用一段時(shí)間后會使色譜柱柱效降低，峰出現(xiàn)拖尾和肩峰;而后者分析靈敏度較低，也有一定程度的拖尾。二者在一定程度上均會影響分析效果。最后實(shí)驗(yàn)采用甲醇-10 mmol·L-1NaH2PO4(38∶62)為流動(dòng)相，其具有分離度高，靈敏度強(qiáng)，峰形較好，可準(zhǔn)確快速的測定鹽酸青藤堿 PLGA納米粒的包封率和載藥量。

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