動物腦、周圍神經(jīng)干及骨骼肌內(nèi)乙酰膽堿酯酶在死后不同時間的降解比較

楊勝波 張 永 張仕斌 劉茂生 蔣彥軍 李壽田 唐 謙

1(遵義醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,遵義563000)

2(遵義醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,遵義563000)

乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)在膽堿能神經(jīng)細(xì)胞體合成,經(jīng)軸漿流快速運(yùn)輸?shù)竭_(dá)骨骼肌,分解乙酰膽堿,調(diào)節(jié)骨骼肌的舒縮。有人曾對尸僵不同時期肌肉的形態(tài)改變和磷酸化酶的改變作過研究[1,2],也有人對鼠不同溫度條件下骨骼肌內(nèi)AChE、琥珀酸脫氫酶、乳酸脫氫酶和鈣激活三磷腺苷酶的變化做了對比研究,建議檢測AChE作為法醫(yī)學(xué)指標(biāo)[3]。本文擬在同一溫度條件下,對不同動物,不同組織內(nèi)的AChE作比較,以證實其作為法醫(yī)學(xué)檢測證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與取材

成年家兔、SD大鼠和犬各30只,隨機(jī)分為5組,每組6只。分別為0、3、6、12、24 h組?？諝馑ㄈc頸部脫臼處死動物,置于實驗室內(nèi)。分別于0、3、6、12、24 h進(jìn)行取材,取各動物大腦額葉皮質(zhì)0.5×0.5 cm;腘窩處坐骨神經(jīng)干0.5～1 cm;腓腸肌中部0.5 ×0.5 m大小的組織塊。實驗都在冬春季節(jié)進(jìn)行的?？刂剖覝卦?4℃～20℃,避免溫度的影響。

1.2 Karnovsky-Roots乙酰膽堿酯酶組織化學(xué)法

將標(biāo)本置于10%中性甲醛,4℃冰箱內(nèi)固定1小時,PBS反復(fù)沖洗,OCT包埋,冰凍切片10μm厚,每個組織塊取20張切片。白膠玻片上自然涼干,4℃Karnovsky-Roo ts孵育液中孵育24h,雙蒸水沖洗,甘油明膠封片。Leica圖像分析儀上對每張切片隨機(jī)抽的5個視野進(jìn)行灰度值測量。每份孵育液:碘化乙酰硫代膽堿12.5mg,雙蒸水2 m l,0.1 M磷酸氫二鈉9 m l,0.1 M磷酸二氫鈉7 m l,30 mM硫酸銅2.5 m l,5 mM鐵氰化鉀2.5 m l,0.1 M檸檬酸鈉1 m l。孵育液孵育前20分鐘配制而成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同種動物大腦皮質(zhì)AChE死后不同時間的降解比較

如表1顯示,家兔、SD大鼠和犬大腦皮質(zhì)AChE灰度值從死后0h至24h的遞增范圍分別是186.74～248.55;183.58～247.36;185.28～246.01。其活性分別降低了33.09%;34.74%;32.77%。對不同動物死后同一時間點(diǎn)上的灰度值作 q檢驗,P> 0.05,而同種動物和不同種動物死后的不同時間之間作t檢驗,P<0.05。

2.2 不同種動物坐骨神經(jīng)干內(nèi)AChE在死后不同時間的降解比較

從表2得知,家兔、SD大鼠和犬坐骨神經(jīng)干內(nèi)AChE灰度值從死后0h至24h的遞增范圍分別是180.23～244.29;179.44～246.26;181.58～247.91。其活性分別降低了35.54%;37.23%;36.52%。對不同動物死后同一時間點(diǎn)上的灰度值作q檢驗,P> 0.05,而同種動物和不同種動物死后的不同時間之間作t檢驗,P<0.05。

2.3 不同種動物腓腸肌內(nèi)AChE死后不同時間的降解比較

如表3顯示,家兔、SD大鼠和犬腓腸肌內(nèi)AChE灰度值從死后0h至24h的遞增范圍分別是176.39～237.47;173.51～238.05;173.77～232.61。其活性分別降低了34.62%;37.19%;33.86%。對不同動物死后同一時間點(diǎn)上的灰度值作 q檢驗,P> 0.05,而同種動物和不同種動物死后的不同時間之間作t檢驗,P<0.01。

2.4 動物死后三種組織內(nèi)AChE降解的比較

三種組織內(nèi)死后同一時間的AChE比較,總是大腦皮質(zhì)灰度值最大,坐骨神經(jīng)干內(nèi)次之,腓腸肌內(nèi)值最小。三種組織內(nèi)的AChE灰度值在死后同一時間與不同時間的q檢驗,p<0.01,不同種動物同一組織內(nèi)AChE在死后同一時間上的比較,P>0.05(見表1～3)。

表1 不同動物大腦皮質(zhì)AChE在死后不同時間的降解變化(灰度值,±s)Tab.1 Degradative changes of AChE of cortex in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表1 不同動物大腦皮質(zhì)AChE在死后不同時間的降解變化(灰度值,±s)Tab.1 Degradative changes of AChE of cortex in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

0h 3h 6h 12h 24h家兔 186.74±11.30 214.01±11.43 224.98±18.06 231.03±21.30 248.55±18.65 SD大鼠 183.58±15.36 215.44±17.01 225.44±19.56 236.55±22.06 247.36±17.16犬185.28±14.33 215.65±16.13 221.73±17.98 233.46±22.69 246.01±14.91

表2 不同動物坐骨神經(jīng)干內(nèi)AChE在死后不同時間的降解變化(±s)Tab.2 Degradative changes of AChE of sciatic nerve trunk in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表2 不同動物坐骨神經(jīng)干內(nèi)AChE在死后不同時間的降解變化(±s)Tab.2 Degradative changes of AChE of sciatic nerve trunk in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

0h 3h 6h 12h 24h家兔 180.23±19.87 210.00±11.03 224.08±10.60 234.18±16.35 244.29±11.06 SD大鼠 179.44±16.35 213.68±14.65 226.40±11.73 237.23±15.19 246.26±13.51犬181.58±17.88 210.45±12.38 229.04±12.49 231.77±16.22 247.91±11.80

表3 不同動物腓腸肌內(nèi)AChE在死后不同時間的降解變化(灰度值,±s)Tab.3 Degradative changes of AChE of grastromem ius in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

表3 不同動物腓腸肌內(nèi)AChE在死后不同時間的降解變化(灰度值,±s)Tab.3 Degradative changes of AChE of grastromem ius in different animalsat postmortem intervals(IOD value,±s)

死后0h 死后3h 死后6h 死后12h 死后24h家兔 176.39±10.87 189.57±10.95 191.31±13.09 224.02±14.68 237.47±11.53 SD大鼠 173.51±11.02 188.58±11.32 194.38±11.81 225.46±10.85 238.05±12.04犬173.77±13.37 187.98±10.78 196.78±12.21 226.54±13.35 232.61±11.73

3 討論

AChE在運(yùn)動神經(jīng)元胞體合成,經(jīng)軸漿運(yùn)輸?shù)竭_(dá)突觸間隙,是膽堿能活性的重要標(biāo)記[4]。正常生理情況下,神經(jīng)末端釋放的乙酰膽堿結(jié)合到運(yùn)動終板處煙堿型乙酰膽堿受體的α1亞基上,并使肌細(xì)胞膜在突觸部位去極化,該局部的去極化導(dǎo)致附近電壓門控鈉通道的活化,使動作電位沿肌纖維表面放大和擴(kuò)散,引起肌肉收縮,繼而AChE水解乙酰膽堿,終止神經(jīng)傳遞,肌肉松弛。為了在時空里能嚴(yán)格控制膽堿能神經(jīng)興奮的傳遞,AChE在突觸間隙的積聚,是一個必要條件。AChE在突觸間隙是穩(wěn)定的,突觸外周是可動的[5]。而AChE在突觸基底膜的積聚依賴于三元絡(luò)合物(膠原Q、基底膜蛋白多糖、肌肉特殊激酶)的介導(dǎo)與綁定[6]。

目前所用的酶組織化學(xué)染色在觀察結(jié)果時常采用半定量方法,有一定缺陷。而灰度是指黑白圖像中點(diǎn)的顏色深度,范圍一般從0到255,白色為255,黑色為0,即組織染色越深,灰度值越小。本實驗結(jié)果中如果灰度值越小,則乙酰膽堿酯酶活性越強(qiáng),降解越少。酶組織化學(xué)染色,常由于實驗條件不一致,染色的強(qiáng)度則發(fā)生差異,為了避免該方法的這一缺點(diǎn),采用不同時間組的動物組織在同一條件下(溫度、切片厚度、孵育液PH值和孵育時間等)進(jìn)行,排除人為干擾,有機(jī)結(jié)合圖像分析,結(jié)果較可靠,在判斷死亡時間上則更具有價值。本實驗未作脊髓前角內(nèi)運(yùn)動細(xì)胞體AChE的降解檢測,出于取材方便的考慮,取了大腦皮質(zhì)。

不同動物和不同組織內(nèi)AChE的灰度值從死后0 h至24 h逐漸遞增,即死后酶降減逐漸加重。同種動物三種組織內(nèi)死后同一時間的AChE比較,總是大腦皮質(zhì)灰度值最大,坐骨神經(jīng)干內(nèi)次之,腓腸肌內(nèi)值最小。這是因為AChE在神經(jīng)細(xì)胞體合成,經(jīng)過軸突運(yùn)輸達(dá)到運(yùn)動終板的。因突觸間隙的特殊位置以及AChE自身的耐活性質(zhì),腓腸肌內(nèi)出現(xiàn)反應(yīng)最明確,穩(wěn)定性最高,降解最緩慢。三種組織內(nèi)的ACh E灰度值在死后同一時間與不同時間的比較,P <0.01,不同種動物同一組織在同一時間上的比較 P >0.05,無統(tǒng)計學(xué)差異,因此,可用它來作為法醫(yī)學(xué)推斷人死亡時間的檢測指標(biāo)。

[1] Sanes JR,Lichtman JW.Development of the vertebrate neuromuscular junction[J].Annu Rev Neurosci,1999,22:389-442.

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[3] Jun WH,Bing L,Yan Z,et al.A study on the degradative changes of acetylcholin esterase(AChE)of the skeletal muscle motor end-plate at various postmortem intervals——a quantitive enzyme histochemical analysis[J].Chinese Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2000,9(4):474-479.

[4] Wu P,Tarasenko Y,Gu Y,et al.Region-specific generation of cholinergic neurons from fetal human neural stem cells grafted in adult rat[J].Nat Neurosc 2002,5(12):1271-1276.

[5] Martinez-Penay Valenzuela I,Akaaboune M.Acetylcholinesterase Mobility and Stability at the Neuromuscular Junction of Living Mice[J].Molecular Biology of the Cell,2007,18(8):2904-2911.

[6] Annie C,Laure S,Manuel G,et al.M uSK is required for anchoring acetylcholinesterase at the neuromuscular junction[J]. The Journal of Cell Biology,2004,165,(4):505-551.