腸道病毒71型滅活疫苗免疫恒河猴在攻毒實(shí)驗(yàn)中的感染動力學(xué)

王晶晶，趙紅玲，張瑩，劉龍丁，王麗春，廖蕓，董承紅，納銳雄，張雪梅，李琦涵

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118

隨著手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)在亞洲地區(qū)流行范圍的擴(kuò)大及感染人群的增加[1,2]，其公共衛(wèi)生意義顯得日益重要[1]，重要原因之一就是HFMD的主要感染病原——腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)可引起少數(shù)患者出現(xiàn)臨床預(yù)后較嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)綜合征及心肺功能衰竭綜合征[3,4]。此類病例的存在，使HFMD對嬰、幼兒群體產(chǎn)生較大的健康威脅。在目前尚無特異性抗病毒藥物的情況下，具有較清楚經(jīng)驗(yàn)背景的滅活病毒疫苗的研究顯然成為重要選擇[5]。值得注意的是，雖然同為腸道病毒屬的脊髓灰質(zhì)炎和甲型肝炎滅活疫苗均已有非常成熟的研制背景[6,7]，但EV71作為一種感染病理機(jī)制尚不完全清楚的病原，其疫苗如何通過誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)，包括經(jīng)中和抗體和特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)發(fā)揮免疫保護(hù)作用，是一個(gè)需深入研究的工作。到目前為止，EV71疫苗的研究還沒有系統(tǒng)的質(zhì)量指標(biāo)，因此其在動物體內(nèi)誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)和相關(guān)的細(xì)胞免疫反應(yīng)能在何種水平上具有免疫保護(hù)意義，成為迫切需要探討的問題。特別是目前多數(shù)EV71疫苗有效性的評價(jià)尚停留在小鼠或乳鼠的動物模型水平，這一研究的應(yīng)用意義顯得尤為重要。

我們在前期進(jìn)行的EV71滅活疫苗開發(fā)的基礎(chǔ)上，探討并建立了恒河猴為對象的EV71感染動物模型[8]。在這一動物模型中，EV71在感染機(jī)體的神經(jīng)、血液及淋巴系統(tǒng)中，表現(xiàn)出相應(yīng)的增殖規(guī)律(待發(fā)表)。以該動物模型為基礎(chǔ)，進(jìn)一步對同期研發(fā)的EV71滅活疫苗進(jìn)行了免疫保護(hù)性分析。我們所研制的EV71滅活疫苗在按0、4周的程序免疫恒河猴后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生明確的中和抗體反應(yīng)和表現(xiàn)為針對γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)特異Elispot反應(yīng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)[9]。但疫苗使用劑量不同，中和抗體反應(yīng)水平有差異。盡管這些中和抗體在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及乳鼠保護(hù)性實(shí)驗(yàn)中均能阻斷一定量病毒的感染[9]，但在恒河猴體內(nèi)是否可完全保護(hù)機(jī)體免受病毒感染尚無定論。因此，本研究采用特定EV71滅活病毒實(shí)驗(yàn)性疫苗免疫恒河猴，利用病毒攻擊實(shí)驗(yàn)和動物體內(nèi)病原學(xué)及病理學(xué)指標(biāo)，具體分析實(shí)驗(yàn)性疫苗免疫后的動物對病毒攻擊所產(chǎn)生的感染動力學(xué)反應(yīng)，為確定EV71滅活疫苗免疫劑量的研究提供直接依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

Vero細(xì)胞(來自世界衛(wèi)生組織，經(jīng)檢定可用于疫苗生產(chǎn))于含有5%小牛血清的DMEM營養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)。人胚肺成纖維細(xì)胞KMB17株(購自醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，經(jīng)檢定可用于疫苗生產(chǎn))于含有8%小牛血清的DMEM營養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)。病毒EV71來源于2008年安徽省阜陽市1名重癥HFMD患兒，經(jīng)分離后接種于Vero細(xì)胞使之增殖，并在KMB17細(xì)胞上適應(yīng)后進(jìn)一步完成毒種的培養(yǎng)制備及相關(guān)檢驗(yàn)。毒種命名為FY-23K-B株，已由中國藥品生物制品檢定所檢定為合格(毒種檢驗(yàn)號200900929)。

1.2 方法

1.2.1EV71實(shí)驗(yàn)性滅活疫苗免疫使用毒種為FY-23K-B株。按相關(guān)生產(chǎn)檢定規(guī)程制備實(shí)驗(yàn)性疫苗[10]，疫苗使用劑量分別為20、80、320 EU。每個(gè)劑量組使用恒河猴9只，同時(shí)設(shè)置未免疫對照猴6只。所有實(shí)驗(yàn)動物的使用均根據(jù)云南省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會相關(guān)規(guī)定，并經(jīng)本所動物倫理委員會批準(zhǔn)。免疫程序?yàn)?周初免，第4周加強(qiáng)。

1.2.2疫苗免疫動物病毒攻擊在二次免疫后第12周時(shí)，每劑量組選6只恒河猴經(jīng)鼻腔感染進(jìn)行EV71病毒攻擊。該毒株來源于重癥患者的分離樣品，接種Vero細(xì)胞后獲得， 經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)鑒定，確定為EV71病毒C4亞型，攻擊劑量為每只104.5CCID50/100 μl。

1.2.3檢測疫苗誘導(dǎo)的中和抗體效價(jià)變化各劑量組中未攻擊的3只猴在二次免疫后第2、4、6、8、10、12、14、16周采血，分離血清后檢測中和抗體效價(jià)。樣品稀釋液為2% MEM ，將血清倍比稀釋，56 ℃滅活30 min，4 ℃放置過夜后檢測。上樣量為50 μl/孔，中和病毒量為300～500 CCID50/孔，同時(shí)設(shè)血清對照組、病毒對照組、細(xì)胞對照組。每天觀察細(xì)胞對照組、血清對照組不出現(xiàn)病變，同時(shí)病毒對照組出現(xiàn)明顯病變，在此基礎(chǔ)上不出現(xiàn)病變的最高血清稀釋度即為該血清的中和抗體效價(jià)。

1.2.4監(jiān)測攻毒后動物體溫變化攻毒后14 d內(nèi)，每天通過肛門監(jiān)測猴體溫2次。

1.2.5RNA提取提取血中總RNA：每天取EDTA抗凝血200 μl，加入800 μl TRNzol-A+，按天根公司TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書操作。提取組織中總RNA：在攻毒后第4、9、14天，將猴電擊處死，分別采取大腦，小腦，延腦，中腦，脊髓頸、胸、腰段，心，肝，脾，肺，腎，胰，淋巴結(jié)等組織器官。初次勻漿后取1.0 g用研磨棒再次勻漿后加入20 ml TRNzol-A+，按天根公司TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書操作。

1.2.6探針及引物利用EV71 FY23株基因序列(GenBank號：EU812515)VP1保守區(qū)設(shè)計(jì)引物及探針。Vp1f(2371～2390)：5′-AGCCCAAA- AGAACTTCACTA-3′；Vp1r(2531～2541)：5′-ATCCAGTCGATGGCTGCTCA-3′；Probe(2411～2438)：5′-FAM-AGTGATATCCTGCAGACG- GGCACCATCC-TAMRA-3′。

1.2.7實(shí)時(shí)PCR檢測病毒載量采用實(shí)時(shí)PCR儀器ABI 7500，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件按TaKaRa公司 One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit 試劑盒說明書操作。同時(shí)將濃度分別為105、104、103、102、101、100、10-1拷貝/μl的EV71 RNA標(biāo)準(zhǔn)品加入同一反應(yīng)板中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

1.2.8Th1/Th2細(xì)胞因子檢測取抗凝血50 μl，加入BD公司Cytometric Bead Array試劑盒(PE染料50 μl和Capture Beads 50 μl)中，室溫避光孵育3 h；加入1 ml Wash Buffer, 2 500 r/min離心5 min；棄上清液后加入300 μl Wash Buffer混勻，上流式細(xì)胞儀檢測白細(xì)胞介素2(interleukin 2，IL-2)、IL-4、IL-6、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和IFN-γ。按試劑盒說明書準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.9病理學(xué)檢查在攻毒后第4、9、14天，電擊處死猴，分別采取大腦，小腦，延腦，中腦，脊髓頸、胸、腰段，心，肝，脾，肺，腎，胰，淋巴結(jié)等組織器官。經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、HE 染色后，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 EV71滅活疫苗誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)

在對二次免疫不同時(shí)間點(diǎn)收集的動物血樣進(jìn)行中和抗體分析中，觀察到3個(gè)不同疫苗劑量免疫的恒河猴均出現(xiàn)不同效價(jià)的中和抗體(圖1)。在20 EU劑量組，二次免疫后第4周，中和抗體水平上升至最高，達(dá)1∶32；之后該抗體水平逐漸下降，至第12周時(shí)，已下降至1∶2左右。但80 EU和320 EU劑量組均表現(xiàn)較高的抗體水平。二次免疫后第6周，該兩劑量組中和抗體達(dá)1∶128～1∶256，之后亦隨時(shí)間延長而下降；至第16周時(shí)，尚維持在1∶16左右。至二次免疫后第12周，20 EU劑量組抗體水平降至最低，約1∶2，而80和320 EU劑量組抗體水平仍然維持在1∶32左右。為比較各劑量組疫苗的保護(hù)效果，本文設(shè)計(jì)二次免疫后第12周進(jìn)行動物保護(hù)疫苗免疫實(shí)驗(yàn)。

圖1不同劑量EV71滅活疫苗所誘導(dǎo)的中和抗體反應(yīng)

Fig.1NeutralizingantibodyresponseinducedbyEV71inactivatedvaccineatdifferentdoses

2.2 病毒攻擊后恒河猴血清炎性因子反應(yīng)

二次免疫后的動物接受經(jīng)鼻腔途徑感染的病毒攻擊后，體溫均在正常范圍內(nèi)波動。而未免疫的對照組動物則出現(xiàn)體溫升高，峰值出現(xiàn)在4～7 d。 在檢測血清炎性因子水平時(shí)，發(fā)現(xiàn)疫苗免疫組動物IL-2、IL-4、IL-6輕度上升，均已超出正常值范圍；TNF-α和IFN-γ亦輕度上升。而在對照動物中，這幾個(gè)指標(biāo)雖有波動，但均在正常參考值范圍內(nèi)(圖2)。同時(shí)，這些指標(biāo)的變化在不同劑量免疫組中亦有差異。

2.3 病毒攻擊后恒河猴血中病毒載量檢測

實(shí)時(shí)定量PCR分析病毒攻擊后14 d內(nèi)的動物血樣，發(fā)現(xiàn)對照組在感染后第4～7天表現(xiàn)血中病毒載量升高的峰形變化。有意思的是，在3個(gè)劑量免疫組的動物中，均未觀察到這一血中病毒載量的陽性變化(圖3)?；蛘哒f，經(jīng)疫苗免疫后的恒河猴，在104.5CCID50病毒鼻腔攻擊后，實(shí)時(shí)定量PCR未在血中檢出病毒。

2.4 病毒攻擊后恒河猴淋巴器官中病毒載量檢測

在對病毒攻擊后的動物第4、9、14天淋巴器官采樣進(jìn)行病毒載量檢測中，觀察到一個(gè)有意義的現(xiàn)象，即20 EU劑量組所有動物淋巴器官(包括多個(gè)淋巴結(jié)及脾)中均有一定數(shù)量病毒載量。盡管與對照組相比，該病毒載量約低1～1.5個(gè)數(shù)量級，但80和320 EU劑量組所有動物均未檢出陽性病毒載量(圖4)。雖然該病毒載量隨時(shí)間呈降低趨勢，但結(jié)果提示，在低劑量組中，EV71可在淋巴器官以低水平增殖存在。

A: IL-2. B: IL-4. C: IL-6. D: IFN-γ. E: TNF-α.

圖2疫苗免疫恒河猴在病毒攻擊后的炎性因子檢測

Fig.2AnalysisoftheinflammatorymarkersinrhesusmonkeysimmunizedbyinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71

圖3疫苗免疫恒河猴血中病毒的實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果

Fig.3ViralloadsinthebloodofrhesusmonkeysimmunizedbyinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71usingquantitativereal-timePCR

2.5 病毒攻擊后恒河猴主要器官病毒載量檢測

我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對恒河猴進(jìn)行EV71鼻腔感染時(shí)，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和一些主要器官如肺、心等檢出病毒增殖(待發(fā)表)。本實(shí)驗(yàn)中，我們對所有疫苗免疫及對照組動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和主要器官做病毒載量檢測時(shí)，亦觀察到20 EU劑量組動物的神經(jīng)、心、肺、腎等均存在低水平病毒增殖，其降低趨勢類似于淋巴器官。而80和320 EU劑量組未能檢出病毒(圖5)，進(jìn)一步證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.6 病毒攻擊后恒河猴的主要組織病理學(xué)變化

部分腸道病毒感染病理學(xué)的研究已提示，病毒在機(jī)體某些靶器官中的增殖?？赡馨橛屑?xì)胞的破壞[11]。我們進(jìn)一步對攻擊后不同時(shí)間點(diǎn)、不同免疫劑量組的動物主要器官進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示，盡管EV71存在于某些器官(如淋巴結(jié)、脾)并不絕對與器官的病理損傷相關(guān)，但至少在中樞神經(jīng)組織(包括大腦、中腦、脊髓)和肺，病毒增殖可導(dǎo)致組織病理改變(表1、2)。

圖4不同免疫劑量組恒河猴在病毒攻擊后淋巴系統(tǒng)中病毒載量的變化

Fig.4ViralloadvariationsinthelymphaticsystemofrhesusmonkeysimmunizedbydifferentdosesofinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71

圖5病毒攻擊后恒河猴主要器官中的病毒載量

Fig.5ViralloadsindifferentmajororgansofrhesusmonkeysimmunizedbyinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71

3 討論

EV71滅活病毒疫苗作為一種尚無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的新疫苗，盡管有些實(shí)驗(yàn)為確定其能誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的有效免疫劑量提供了初步數(shù)據(jù)[12,13]，但由于所采用的動物模型多集中于嚙齒類，故至今尚未能提供令人信服的、可用于人體免疫的有效免疫劑量的數(shù)據(jù)。因此，盡管我們前期已成功完成EV71滅活疫苗的乳鼠研究，并利用定量酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)對這一滅活疫苗的抗原含量作了初步設(shè)定，確定了可引起小鼠免疫反應(yīng)的有效劑量為15.7 EU[9]。但這一劑量能否作為人體試驗(yàn)設(shè)計(jì)的參考，仍無直接的證據(jù)支持。根據(jù)同為腸道病毒屬的甲型肝炎滅活疫苗研究的經(jīng)驗(yàn)，采用更接近于人類的非人靈長類動物進(jìn)行免疫學(xué)分析及保護(hù)性實(shí)驗(yàn)，可為這類疫苗最終在人體的應(yīng)用提供較為可靠的依據(jù)[14]。我們前期有關(guān)EV71感染生物學(xué)的研究，在大量實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上建立了恒河猴感染模型。該模型動物在EV71以104.5CCID50的劑量感染鼻腔(氣霧劑形式)后，可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)、肺、心等檢出病毒，并伴隨相應(yīng)的病理組織學(xué)改變，可觀察到典型的病毒血癥。其血中病毒檢出時(shí)間在4～7 d，5～6 d達(dá)峰值。該模型為分析EV71感染過程提供了病原學(xué)及病理學(xué)的指標(biāo)(待發(fā)表)。因此，我們在進(jìn)行EV71滅活疫苗的免疫學(xué)分析中繼續(xù)使用該模型。本研究結(jié)果表明，經(jīng)EV71滅活疫苗二次免疫的恒河猴均能產(chǎn)生抗EV71的中和抗體反應(yīng)，盡管20 EU劑量誘導(dǎo)的抗體水平較低，但依然與80和320 EU劑量一樣，形成對病毒攻擊的抵御作用。20 EU劑量組動物與80和320 EU劑量組一樣，未出現(xiàn)感染后的體溫改變，而未免疫動物在呼吸道感染EV71后出現(xiàn)典型的體溫升高[9]；在病毒攻擊后的血液病毒載量分析中未觀察到病毒血癥表現(xiàn)(圖3)；在病毒攻擊后的組織病理學(xué)檢查中，動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及肺等器官均未出現(xiàn)相關(guān)病理損傷(表1、2)，而這些陰性指征在未免疫動物中均為陽性(圖3～5，表1、2)。值得注意的是，盡管20 EU劑量組動物的機(jī)體反應(yīng)病理學(xué)指標(biāo)均呈陰性，但在病毒攻擊后2周內(nèi)，其淋巴器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及其他主要臟器均出現(xiàn)比對照組低但仍為陽性的病毒增殖現(xiàn)象；而80和320 EU劑量組均為陰性(圖4、5)。盡管這些器官中的病毒載量并不與器官的病理損傷呈直接相關(guān)性，但病毒在這些器官中的增殖會產(chǎn)生何種病理現(xiàn)象尚不能肯定。這一結(jié)果提示，誘導(dǎo)恒河猴產(chǎn)生完整的、對機(jī)體具有全面保護(hù)意義的EV71滅活疫苗劑量可能具有一個(gè)閾值，這一閾值決定了免疫后機(jī)體在病毒攻擊情況下是否具有全面的保護(hù)效應(yīng)。因此，利用小鼠模型確定的免疫有效劑量至少應(yīng)在靈長類動物中進(jìn)一步驗(yàn)證。我們在小鼠模型中確定的15.7 EU的有效免疫劑量對恒河猴雖可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，但顯然不具有中劑量(80 EU)以上的免疫保護(hù)效果，后者能完全阻斷病毒在體內(nèi)的增殖(圖3～5)，從而完全保護(hù)機(jī)體組織不受病毒感染。根據(jù)免疫恒河猴保護(hù)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，至二次免疫后第12周，雖然20 EU劑量組較對照組在一定程度上誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生了一定的抗體，但抗體僅維持在1∶2。綜合病原學(xué)和病理學(xué)的結(jié)果，該保護(hù)作用并不明顯。然而，80和320 EU劑量組此時(shí)的抗體水平均維持在1∶32左右，基于病原學(xué)和病理學(xué)的觀察，這一劑量已能有效抵御病毒侵襲，保護(hù)效果明顯。由圖1可看出，本實(shí)驗(yàn)所制備的EV71滅活疫苗80和320 EU劑量誘導(dǎo)較高抗體水平，且抗體至少能維持4個(gè)月以上。由此，初步推測在人體的免疫保護(hù)劑量應(yīng)該在80 EU以上，以保證免疫后抗體能上升到一定效價(jià)并維持相應(yīng)時(shí)間。

表1病毒攻擊后疫苗免疫及未免疫恒河猴中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理損傷

Tab.1NeuropathologicalevaluationofrhesusmonkeysunimmunizedorimmunizedbyinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71

DoseMonkey IDTime post-infection (day)Cerebra4914Interbrain4914Pons4914Midbrain4914Thalamus4914Medulla4914Myelon491420 EU0716800?0?0?1?1?10716910?0?0?0?0?00723010?0?1?0?1?10704700?0?0?0?0?00710800?0?0?0?0?00703500?0?0?0?0?080 EU0740100?0?0?0?0?00610700?0?0?0?0?00703300?0?0?0?0?00617700?0?0?0?0?00731000?0?0?0?0?00670100?0?0?0?0?0320 EU0710300?0?0?0?0?00723100?0?0?0?0?00730500?0?0?0?0?00618900?0?0?0?0?00610800?0?0?0?0?00708700?0?0?0?0?0Unimmunized0806111?1?1?1?0?00504411?1?1?1?0?00741211?1?0?0?0?10619110?1?1?0?0?00544400?0?1?0?0?00733101?1?0?0?0?0

Central nervous system (CNS) lesions were scored according to the evaluation standard of the CNS lesion score recommended by the World Health Organization (WHO) (Arita, 2007): 0, no lesion; 1, cellular infiltration; 2, cellular infiltration with minimal neural damage; 3, cellular infiltration with extensive neural damage; and 4, massive neural damage with or without cellular infiltration.

表2病毒攻擊后疫苗免疫及未免疫恒河猴器官病理損傷

Tab.2PathologicalchangesinrhesusmonkeysunimmunizedorimmunizedbyinactivatedvaccinefollowedwithinfectionofEV71

DoseMonkey IDTime post-infection (day)Heart4914Liver4914Spleen4914Lung4914Kidney4914Pancreas4914Lymph node491420 EU0716800?0?1?1?0?00716900?0?0?0?0?00723000?1?1?0?1?00704700?0?1?1?0?10710800?0?0?0?0?00703500?0?1?0?0?080 EU0740100?0?0?1?0?00610700?0?0?0?0?00703300?0?0?0?0?00617700?0?0?0?1?00731001?0?0?0?0?00670100?0?0?0?0?0320 EU0710300?0?0?0?0?00723100?0?0?0?0?00730500?0?0?0?0?00618900?0?0?0?0?00610800?0?0?0?0?00708700?0?0?0?0?0Unimmunized0806111?0?1?0?0?00504410?0?1?0?0?00741210?0?2?0?0?00619101?0?2?0?1?00544400?0?3?0?0?00733100?1?2?0?1?0

0, no obvious pathological change; 1, cellular infiltration; 2, cellular infiltration and damage of tissue; 3, massive cellular infiltration and severe damage of tissue.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，EV71滅活疫苗免疫的恒河猴在接受病毒攻擊時(shí)，其相關(guān)免疫因子亦有相應(yīng)變化(圖2)。IL-2、IL-4和IL-6輕微上升，同時(shí)TNF-α和IFN-γ亦輕度上升。這樣的上升幅度是否具有特定的病理學(xué)意義尚不能定論，但Komisar等[15]對恒河猴免疫病理的綜合分析顯示，這樣的變化并不提示任何免疫病理過程的存在。

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