重組丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表達(dá)、純化和抗體制備

陳輝，高娜，范東瀛，鄭群，王娟，安靜

首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，北京 100069

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV) 是導(dǎo)致慢性肝炎、肝纖維化甚至肝細(xì)胞癌的重要原因之一，全世界感染人數(shù)已超過2.27億，其中中國感染人數(shù)4 000萬， HCV感染已成為全球化的健康難題[1]。HCV相關(guān)肝細(xì)胞癌的分子機(jī)制目前尚不十分清楚，由于缺乏特效治療手段和安全有效的疫苗，所以對其致病機(jī)制的研究已成為HCV 感染亟待解決的前沿課題之一。

HCV屬黃病毒科(Flaviviridae)，根據(jù)5′非編碼區(qū)序列的差異可將不同HCV株分為6個基因型和100多個基因亞型，其中中國內(nèi)地地區(qū)HCV以1b亞型為主。HCV基因組為單正鏈RNA，編碼3 010個氨基酸組成的大分子蛋白單體，包括3種結(jié)構(gòu)蛋白以及至少7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中HCV核心蛋白(HCV core protein, HCV-C) 為由191個氨基酸殘基組成的前體蛋白在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工形成的174個氨基酸多肽片段，是與RNA結(jié)合的親膜α螺旋蛋白二聚體，參與病毒核衣殼的形成，是HCV基因組中較為保守的結(jié)構(gòu)。更重要的是，HCV-C能與宿主細(xì)胞蛋白相互作用，進(jìn)而影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生及脂質(zhì)代謝，參與丙型肝炎的發(fā)生和發(fā)展[2]。特別是HCV-C具有反式激活作用，是導(dǎo)致病毒持續(xù)性感染以及肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要原因，因而備受關(guān)注[3]，但其致病機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。本研究旨在獲得純化的HCV-C，制備抗HCV-C的多克隆抗體，為深入研究HCV-C與肝細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、細(xì)胞、質(zhì)粒和動物

大腸埃希菌JM109和Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。模板質(zhì)粒HCV1b亞型HC-J4全基因組由第二軍醫(yī)大學(xué)戚中田教授惠贈。原核表達(dá)載體pQE31購自Promega公司。真核表達(dá)重組質(zhì)粒pCAGGSP7-HCV-C由本室保存。6～8周齡雌性BALB/c小鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑

鎳親和層析柱購自Invitrogen公司。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。DNA限制性內(nèi)切酶PstⅠ、HindⅢ以及T4連接酶均購自MBI公司。質(zhì)粒抽提試劑盒購自北京博大泰克基因技術(shù)公司。DNA凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司。DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品與蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品購自Fermentas公司。弗氏佐劑購自Gibco BRL公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。小鼠抗HCV-C單克隆抗體(產(chǎn)品編號ab2740)購自Abcam公司。羊抗小鼠IgG-FITC、IgG-HRP購自Sigma公司。其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計和目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增

根據(jù)HCV1b亞型HC-J4-91(GenBank序列號：AF054250)核心蛋白的核苷酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計合成特異性引物(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。pQE31-HCV-C上游引物：5′- GGCACTGCAGATGAGCACGAATCCTAA ACC-3′；下游引物：5′-GTGAAGCTTTTAAGCGGAAGCTGGGAT -3′。上游引物含酶切保護(hù)性堿基及PstⅠ酶切位點(diǎn)(單下劃實(shí)線處)，下游引物含終止密碼子TTA(雙下劃實(shí)線處)、HindⅢ酶切位點(diǎn)(單下劃虛線處)以及酶切保護(hù)性堿基。以HCV1b亞型HC-J4-91全基因組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段。反應(yīng)參數(shù)：在50 μl反應(yīng)體積中依次加入5×PrimeSTARTMbuffer(Mg2+plus) 10 μl，2.5 mmol/L dNTP mixture 4 μl，25 pmol/μl的上、下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，PrimeSTARTMHS DNA polymerase 1 μl，補(bǔ)加雙蒸水至50 μl，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增步驟：95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，58 ℃15 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，紫外分析儀檢測電泳結(jié)果。

1.4 pQE31-HCV-C表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

從瓊脂糖凝膠回收純化PCR產(chǎn)物中572 bp的目的基因片段，PstⅠ、HindⅢ雙酶切后，以T4連接酶于16 ℃反應(yīng)16 h，連接同樣雙酶切的載體pQE31，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pQE31-HCV-C。

1.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌及測序鑒定

將連接產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109工程菌，挑取轉(zhuǎn)化菌落擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR及PstⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定無誤后，將含目標(biāo)序列的重組質(zhì)粒工程菌送大連寶生物工程有限公司測序鑒定。

1.6 融合蛋白6×His-HCV-C誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

1.6.1融合蛋白6×His-HCV-C的異丙基硫代半乳糖苷最佳誘導(dǎo)濃度的確定

將含pQE31-HCV-C質(zhì)粒和pQE31空質(zhì)粒的工程菌分別接種于含100 μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min，培養(yǎng)過夜；次日以1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液A600約0.6，加入異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)至終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收獲菌體，進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分析，積層膠50 g/L，分離膠100 g/L，100 V、15 min后再穩(wěn)壓130 V電泳40 min。

1.6.2融合蛋白6×His-HCV-C的IPTG最佳誘導(dǎo)時間的確定

將含pQE31-HCV-C質(zhì)粒和pQE31空質(zhì)粒的工程菌分別接種于含100 μg/ml氨芐西林的2×YT培養(yǎng)基中，37 ℃，160 r/min，培養(yǎng)過夜；次日以1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液A600約0.6，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，分別誘導(dǎo)表達(dá)0、1、2、3、4、5、6 h后收獲菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析，積層膠50 g/L，分離膠100 g/L，電壓100 V、15 min后再穩(wěn)壓130 V電泳40 min。

1.7 融合蛋白6×His-HCV-C的純化

800 ml菌液經(jīng)離心，收集表達(dá)后所獲的菌體，以Buffer A(50 mmol/L Tris pH 8.0、0.5 mmol/L EDTA、50 mmol/L NaC1、50 ml/L甘油)洗滌2次并重懸，加入1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)及1 mg/ml溶菌酶，超聲破碎后加1 ml/L Triton X-100，4 ℃靜置30 min后，12 000g離心1 h，收集沉淀物，Buffer A洗滌沉淀2次，加入Buffer B(8 mol/L尿素、100 mmol/L NaH2PO4、1 ml/L巰基乙醇、10 mmol/L Tris pH 8.0)，于4 ℃溶解包涵體沉淀。樣品通過鎳親和層析柱，用Buffer C(8 mol/L尿素、100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris pH 6.3)去除雜蛋白，Buffer D(8 mol/L尿素、100 mmol/L NaH2PO4、10 mmol/L Tris pH4.5)洗脫目的蛋白。

經(jīng)透析去除尿素，獲得純化的HCV-C復(fù)性蛋白。利用SDS-PAGE檢測6×His-HCV-C融合蛋白的純度。

1.8 抗HCV-C多克隆抗體的制備

將1 ml 200 μg/ml目的蛋白與等體積弗氏佐劑充分混勻，皮下、腹腔及肌肉多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，每隔3周加強(qiáng)免疫1次，共免疫3次。末次免疫1周后采血，分離血清，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測其抗體效價。

1.9 蛋白免疫印跡

為鑒定所制備抗體的特異性，將純化融合蛋白經(jīng)SDS-PAGE，80 V電泳2 h，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜，用自制的小鼠抗HCV-C血清(1∶500 稀釋)與膜4 ℃孵育過夜。以羊抗鼠IgG-HRP為二抗，二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine，DAB)顯色觀察，至目的條帶清晰終止反應(yīng)。

1.10 間接免疫熒光染色

制備Vero細(xì)胞的細(xì)胞爬片，提取真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGSP7-HCV-C DNA，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，48 h后取出，經(jīng)40 ml/L聚合甲醛固定、2 ml/L Triton X-100/磷酸緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)通透后，以10 ml/L 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)/PBS室溫封閉1 h，加入制備的小鼠抗HCV-C血清(1∶200稀釋)或市售小鼠抗HCV-C單克隆抗體(1:200稀釋)，4 ℃孵育過夜。漂洗后加入羊抗鼠IgG-FITC，室溫孵育1 h，經(jīng)漂洗、干燥后，用400 ml/L甘油封片，熒光顯微鏡(Olympus BX61)觀察。

2 結(jié)果

2.1 HCV-C DNA片段的獲得及克隆入載體pQE31

以HCV1b亞型HC-J4-91全基因組質(zhì)粒為模板，利用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖電泳鑒定，可見500～750 bp特異性條帶，與預(yù)期目的基因572 bp片段長度相符。將PstⅠ、HindⅢ雙酶切目的基因片段連接于同樣雙酶切的載體pQE31并轉(zhuǎn)化JM109工程菌，提取重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及PstⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物與酶切產(chǎn)物中均含572 bp目的基因片段(圖1)。重組質(zhì)粒pQE31-HCV-C經(jīng)測序，證實(shí)目的基因片段正確插入pQE31載體的單克隆位點(diǎn)，并保持正確的讀碼框架。

1,recombinant plasmids; 2, PCR amplification; 3,PstⅠ/HindⅢ digestion.

圖1pQE31-HCV-C重組原核表達(dá)質(zhì)粒酶切及PCR鑒定圖譜

Fig.1RestrictionmapandPCRanalysisofpQE31-HCV-C

2.2 融合蛋白6×His-HCV-C 的原核表達(dá)

按照前述方法，將含pQE31-HCV-C質(zhì)粒的重組工程菌以終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收獲菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，與空載體標(biāo)本及誘導(dǎo)前標(biāo)本相比，誘導(dǎo)標(biāo)本中出現(xiàn)22 000的新生蛋白條帶(圖2)。融合蛋白主要以包涵體形式存在，其相對分子質(zhì)量與預(yù)期相符，且IPTG終濃度為0.6 mmol/L時，誘導(dǎo)表達(dá)6 h目的蛋白表達(dá)量最高，故以此確定為融合蛋白6×His-HCV-C的IPTG最佳誘導(dǎo)條件。

1 and 2, JM109/pQE31 induced by 1.0 mmol/L IPTG for 0 h and 6 h, respectively; 3-8, JM109/pQE31-HCV-C induced by 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L IPTG for 6 h.

圖2SDS-PAGE分析不同濃度IPTG誘導(dǎo)融合蛋白6×His-HCV-C的原核表達(dá)

Fig.2SDS-PAGEanalysisoftheprokaryoticexpressionof6×His-HCV-CfusionproteininducedbyIPTGatdifferentconcentrations

2.3 融合蛋白6×His-HCV-C的純化及純度分析

將含pQE31-HCV-C質(zhì)粒的重組工程菌以終濃度0.6 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后收獲菌體，超聲破碎后菌體沉淀物經(jīng)鎳親和層析獲得純化融合蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分析，蛋白相對分子質(zhì)量約22 000。灰度掃描結(jié)果顯示，純化融合蛋白的純度達(dá)90%(圖3)。

1, purified 6×His-HCV-C fusion protein; 2,E.coliJM109 strains expressing 6×His-HCV-C fusion protein induced by IPTG at 0.6 mmol/L for 6 h.

圖3純化后融合蛋白的SDS-PAGE電泳分析

Fig.3SDS-PAGEanalysisofthepurified6×His-HCV-Cfusionprotein

2.4 HCV-C多克隆抗體的制備及檢測

小鼠抗血清經(jīng)間接ELISA檢測，抗體效價達(dá)1∶12 800。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果證明，1∶500 稀釋的自制小鼠抗HCV-C多克隆抗體能夠與誘導(dǎo)表達(dá)的6×His- HCV-C發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)(圖4)。

1, polyclonal antibodies against HCV-C; 2, normal mouse serum.

圖4蛋白免疫印跡鑒定小鼠抗HCV-C抗血清

Fig.4IdentificationofpolyclonalantibodiesagainstHCV-CbyWesternblot

2.5 間接免疫熒光染色

將真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGSP7-HCV-C轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，48 h后取出，利用自制小鼠抗血清作為一抗進(jìn)行染色，觀察HCV-C的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Vero細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)明顯的特異性熒光，與市售小鼠抗HCV-C單克隆抗體分布模式一致，表明自制小鼠抗HCV-C多克隆抗體可特異性識別真核表達(dá)的HCV-C(圖5)，而正常血清對照組無特異性熒光。

A: The polyclonal antibodies against HCV-C. B: Commercial monoclonal antibodies against HCV-C. C: Normal mouse serum.

圖5間接免疫熒光染色檢測HCV-C在Vero細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.5DetectionofHCV-CexpressioninVerocellswithantibodiesagainstHCV-Cbyindirectimmunofluorescencestaining

3 討論

在HCV編碼的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中，HCV-C的功能最復(fù)雜，除在病毒顆粒裝配與成熟過程中起關(guān)鍵作用外[4]，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、脂代謝、病毒基因表達(dá)及抗原呈遞等。HCV-C與宿主細(xì)胞的多種蛋白相互作用可能是HCV慢性感染，肝細(xì)胞損傷以至肝細(xì)胞癌變發(fā)生、發(fā)展的主要成因[5]。有研究認(rèn)為，HCV感染后，HCV-C等可通過免疫病理反應(yīng)造成肝細(xì)胞損傷，誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。凋亡的肝細(xì)胞可刺激單核-巨噬細(xì)胞等釋放白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF α)等大量炎性細(xì)胞因子，影響肝細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終可能導(dǎo)致肝癌發(fā)生[6,7]。研究證明，HCV-C前體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上被信號肽酶切掉C端疏水區(qū)后，加工為成熟的HCV-C，可與核蛋白酶活化分子PA28γ聯(lián)合作用，致使肝細(xì)胞變性、壞死[8]。這種作用可能與HCV-C誘導(dǎo)肝組織中活性氧的表達(dá)有關(guān)。此外，HCV-C可作用于腫瘤相關(guān)的重要信號通路，抑制肝癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖并轉(zhuǎn)化。Herzer等[9]發(fā)現(xiàn)，HCV-C可通過與P53蛋白的共活化分子相互作用，阻止抑癌基因p53激活。Battaglia等[10]研究指出，HCV-C能抑制轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF β)介導(dǎo)的抑癌通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖的失調(diào)。

HCV-C也是HCV與宿主免疫細(xì)胞相互作用的主要環(huán)節(jié)，在HCV感染后的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[11]。Zimmermann等[12]用表達(dá)HCV-C的小鼠肝細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HCV-C可通過下調(diào)抗原呈遞細(xì)胞的組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子、α干擾素(interferon α，IFN α)和TNF α表達(dá)的同時，誘導(dǎo)調(diào)控性細(xì)胞因子IL-10的生成，從而抑制CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)起始，造成HCV在體內(nèi)不易被清除而呈長期慢性感染。此外，HCV-C還可通過上調(diào)無反應(yīng)基因和新異基因的表達(dá)影響T細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境，造成機(jī)體免疫功能障礙[13]。由此可見HCV-C在HCV感染與致病中具有重要作用，但機(jī)制較為復(fù)雜，尚未完全闡明。

為深入研究HCV-C 與肝細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了HCV-C的原核表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)而獲得其純化蛋白并制備了抗HCV-C的多克隆抗體。實(shí)驗(yàn)中采用的pQE31原核表達(dá)載體帶有6個連續(xù)組氨酸殘基序列，與目的基因片段共同表達(dá)后，組氨酸標(biāo)簽可與鎳螯合，使目的蛋白被特異性吸附于親和層析柱；再利用pH梯度分段洗脫，達(dá)到分離、純化蛋白的目的。結(jié)果表明，該方法獲得的純化融合蛋白相對分子質(zhì)量約22 000，純度較高，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。利用此重組蛋白免疫小鼠，所制備的抗血清效價較高，并能特異性識別自然狀態(tài)(免疫熒光染色)和變性的(蛋白免疫印跡)HCV-C，說明該抗血清可用于ELISA、蛋白免疫印跡以及免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)研究。進(jìn)一步以市售單克隆抗體為對照，進(jìn)行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)與自制抗體的特異性染色分布方式一致，說明所制備的抗體有較好的實(shí)用性。該制備方法簡單，所獲抗體有實(shí)用價值，克服了市售抗體價格昂貴的缺點(diǎn)，為進(jìn)一步研究HCV-C與肝細(xì)胞相互作用的分子機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)工具。

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