實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血腦內(nèi)Bax、Bcl2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

魏秀娥 榮良群

徐州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 徐州 221006

Qureshi等許多研究均證實(shí)［1－3］，細(xì)胞凋亡機(jī)制參與了腦出血的繼發(fā)性損傷，是腦出血后血腫周圍區(qū)細(xì)胞死亡的主要方式，Bcl－2基因家族在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。Bcl－2是重要的凋亡抑制基因，Bax是Bcl－2基因家族中重要的凋亡促進(jìn)基因，其基因產(chǎn)物Bcl－2、Bax是重要的凋亡調(diào)控蛋白，Bax可通過其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體而發(fā)揮作用。Bax同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡。Bax、Bcl－2是否在腦出血中表達(dá)及其特點(diǎn)，國內(nèi)外報(bào)道不一，因此，本實(shí)驗(yàn)擬利用自體血注入法建立大鼠ICH模型，對ICH凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl－2表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究，以期在有效的時(shí)間窗內(nèi)爭取通過上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl－2和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡，為臨床治療腦出血提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠84只，清潔級，成年雄性，體質(zhì)量220～250g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑：Bax Bcl－2 抗體（Santa Cruz Biotechnology，USA），二步法免疫組化檢測試劑（北京中山生物科技有限公司品），DAB顯色試劑盒（北京中山生物科技有限公司產(chǎn)品）。

1.1.3 主要儀器：動(dòng)物立體定位儀（江灣二型），100μL微量進(jìn)樣器（浙江省醫(yī)用器械廠），KD1508轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），OLYMPUS光學(xué)顯微鏡（日本），遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），電子分析天平（HR2140美國，精密度0.0001g）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備：參照Yang等［5］報(bào)道的方法改進(jìn)，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜［4］確定尾狀核的位置：前囟前0.2 mm，矢狀縫向右3.0mm，深6.3mm為注射點(diǎn)。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（350mg／kg）腹腔麻醉俯臥位固定于立體定位儀上，頭皮正中消毒后矢狀位切開約1.5cm，暴露前囟點(diǎn)，據(jù)圖譜調(diào)整立體定位儀于注射點(diǎn)（A 0.2mm L 3.0mm V 6.3 mm），鉆顱打孔（直徑約1mm）將鼠尾置于40℃水溫浴10 min后取出擦干消毒，距離鼠尾末端3cm處剪斷，用100μL微量進(jìn)樣器吸取新鮮血液約50μL，迅速插入已鉆好孔內(nèi)，進(jìn)針6.3mm（相當(dāng)于尾狀核位置），注射時(shí)間不少于15min，留針10min緩慢退針，局部碘伏消毒后，縫合切口皮膚。大鼠清醒后無偏癱體征（Longa評分）者棄用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物給藥：正常組（Nor組）：不做任何處理，12只。生理鹽水組（NS組）：注入生理鹽水50μL，36只。出血組（ICH組）：立體定位后注入新鮮未凝血50μL，造模成功后3h原位固定后注入生理鹽水5μL，共36只。以上各組分別在6h、12h、24h、48h、72h、7d隨機(jī)處死大鼠各6只，用于免疫組化染色。

1.2.3 大鼠腦灌注固定及免疫組化染色：造模成功后大鼠分別于各時(shí)相點(diǎn)經(jīng)10%水合氯醛深度麻醉后，經(jīng)升主動(dòng)脈快速灌注37℃生理鹽水100mL，然后以250mL固定液（4℃0.01MPB PH 7.4 4%多聚甲醛）灌注固定腦組織，30min內(nèi)灌完，取全腦，去除小腦和腦干，置于上述固定液中后固定24 h，繼入20%、30%蔗糖液（4℃0.01MPB PH 7.4），直至組織塊沉底。將固定腦組織放在恒冷切片機(jī)上切取30μm厚的連續(xù)冠狀切片，于尾側(cè)向頭側(cè)隨機(jī)隔6片取一組鄰片，置于PBS中，進(jìn)行免疫組化染色。Bax、Bcl－2均采用漂染法，以PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.4 計(jì)數(shù)方法：免疫組化所有結(jié)果在10、20、40倍目鏡下觀察，采用40倍目鏡計(jì)數(shù)每張腦片4個(gè)視野，一只大鼠測兩張腦片，獲得8個(gè)數(shù)值取其均數(shù)為一只大鼠的最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

2.1.1 bcl－2表達(dá)：陽性細(xì)胞染色均以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，多見于血腫周圍基底節(jié)區(qū)，并可顯示細(xì)胞輪廓；Nor組未見陽性細(xì)胞表達(dá)；NS組偶有表達(dá)，但各時(shí)相點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組各時(shí)相點(diǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果見表1。

表1 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周圍bcl－2陽性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

表1 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周圍bcl－2陽性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

注：NS組各時(shí)相點(diǎn)均見少量陽性細(xì)胞表達(dá)，組內(nèi)比較，＊P＞0.05；出血組同時(shí)相點(diǎn)與NS組比較，▲P＜0.01

6h 12h 24h 48h 72h 7d Nor組組別0 NS組 4.3±0.6＊ 4.4±0.7＊ 4.9±0.7＊ 5.1±0.8＊ 5.1±0.8＊ 5.0±0.7＊ICH組 6.2±0.9 11.0±1.2▲ 18.4±2.0▲ 30.4±2.9▲ 21.3±1.9▲ 16.9±1.7▲

2.1.2 bax表達(dá)：大鼠腦組織bax陽性細(xì)胞在出血組織及血腫周圍均有表達(dá)，細(xì)胞染色形式以胞漿有棕黃色物質(zhì)沉積為主，并可顯示出細(xì)胞輪廓，血腫組織中的陽性神經(jīng)元形態(tài)變化較大，胞體形態(tài)多不規(guī)則。NS組未見bax陽性表達(dá)，而ICH組6h出現(xiàn)表達(dá)，12h表達(dá)明顯增加，1d達(dá)峰值，3d時(shí)陽性細(xì)胞明顯減少，7d時(shí)仍持續(xù)存在，計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。

表2 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周圍bax陽性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

表2 各組各時(shí)相點(diǎn)血腫周圍bax陽性細(xì)胞數(shù) （個(gè)，）／高倍鏡視野

Nor組0 NS組 0 ICH 組 5.5±0.5 17.9±0.9 27.5±0.93 22.4±1.1 13.2±0.9 6.23±0.81

3 討論

既往研究表明，腦出血后腦損傷不僅是血腫的占位效應(yīng)和血腫對周圍腦組織的直接破壞所致，腦出血后rCBF下降、灶周再灌注損傷、腦水腫形成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等均參與了腦出血繼發(fā)性損傷，近年來研究表明，作為一種基因調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞凋亡參與了腦出血后神經(jīng)細(xì)胞損傷過程［6］，具體機(jī)制尚不清晰，分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞凋亡是機(jī)體在生長、發(fā)育和受到外來刺激時(shí)清除多余、衰老和受損傷的細(xì)胞以保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡的一種自我調(diào)節(jié)機(jī)制。bcl－2基因家族包含抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡兩類功能相反的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［7］。其中Bcl－2是重要的凋亡抑制基因，具有促進(jìn)細(xì)胞生存的作用，位于凋亡基因網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部位，阻止促凋亡信號的傳遞或其產(chǎn)物發(fā)揮作用；而bax是bcl－2基因家族中重要的凋亡促進(jìn)基因作用于細(xì)胞凋亡的晚期環(huán)節(jié)。正常情況下，Bax、Bcl－2在細(xì)胞中的表達(dá)處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，并受到機(jī)體的嚴(yán)格調(diào)控［8］。Bcl－2、Bax蛋白是重要的凋亡調(diào)控蛋白，Bax可通過其自身形成的Bax同二聚體和（或）與Bcl－2形成Bax－Bcl－2異二聚體而發(fā)揮作用。Bax同二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bax－Bcl－2異二聚體則抑制細(xì)胞凋亡。既往研究認(rèn)為腦出血后早期凋亡相關(guān)蛋白以NF－κB等促凋亡蛋白增高為主，是臨床癥狀加重的可能因素，當(dāng)?shù)蛲鲆种频鞍譎SP70等表達(dá)增強(qiáng)時(shí)癥狀趨于穩(wěn)定［9］。本實(shí)驗(yàn)中Nor組與NS組右側(cè)基底節(jié)區(qū)均未見Bax陽性細(xì)胞表達(dá)，ICH組特別是出血中心區(qū)損傷最重，神經(jīng)元變性較重，可見壞死、炎癥細(xì)胞浸潤，亦未見Bax、Bcl－2表達(dá)。而血腫周圍區(qū)Bax在出血后6h即出現(xiàn)表達(dá)，24h達(dá)到高峰，NS組即可見Bcl－2少量表達(dá)，ICH組Bcl－2在12h表達(dá)明顯，48h達(dá)高峰，術(shù)后7d二者陽性表達(dá)仍持續(xù)存在。通過對腦出血大鼠血腫周圍Bax、Bcl－2蛋白動(dòng)態(tài)監(jiān)測，進(jìn)一步證實(shí)了在腦出血的發(fā)生和演變中的確出現(xiàn)了Bax、Bcl－2蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)失衡。Bax促凋亡作用的機(jī)制可能［10］與Bax蛋白在線粒體膜上形成同源二聚體，產(chǎn)生離子通道，造成細(xì)胞內(nèi)鈣超載，激活一系列酶，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡；而Bcl－2在腦出血損傷過程中的作用機(jī)制與其具有抗氧化劑作用，可通過抑制超氧化物的產(chǎn)生和作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)Bcl－2還可能通過抑制Ca2＋的釋放［11］，阻止促凋亡基因信號的傳遞，或阻止這些誘導(dǎo)基因產(chǎn)物如Bax、P53等［12］而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。出血24h后Bax蛋白表達(dá)達(dá)高峰，Bax－Bax同二聚體形成增加，促進(jìn)出血早期細(xì)胞凋亡的發(fā)生，之后Bax表達(dá)漸減少，且凋亡抑制蛋白Bcl－2表達(dá)漸增加，48h后達(dá)高峰，Bax－Bcl－2異二聚體形成增加，抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使Bax／Bcl－2在分子水平達(dá)到新的動(dòng)態(tài)平衡，結(jié)果表明，凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl－2參與了出血后腦損傷，為臨床開發(fā)治療腦出血的藥物提供新的思路。

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