高糖及糖波動對單核巨噬細胞分泌MMP-9的影響*

鄭冠琳，亓文波，楊利波

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰安醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 泰安 271000)

糖尿病是冠心病的等危癥。與非糖尿病患者相比，糖尿病患者患心血管病的幾率高2～4倍[1]。高血糖與動脈粥樣硬化密切相關(guān)，然而反映血糖水平的金指標(biāo)HbA1c卻顯示與心血管終點事件有弱相關(guān)性[2]。相反，近來流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，餐后高血糖是動脈粥樣硬化的獨立危險因素[3]，血糖波動與糖尿病大血管病變相關(guān)性的大型流行病學(xué)研究結(jié)果也提示餐后高血糖較恒定血糖水平更能加劇糖尿病動脈粥樣硬化的發(fā)生[4]。而血糖波動與糖尿病動脈粥樣硬化的關(guān)系及機制的研究目前尚處于初步階段。眾所周知，動脈粥樣硬化的發(fā)生與MMP-9密切相關(guān)[5]。MMP-9是明膠酶的一種，它可以降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，目前許多研究證實血清MMP-9水平與糖尿病動脈粥樣硬化、冠狀動脈病變程度及斑塊的穩(wěn)定性關(guān)系密切[6，7]。在體內(nèi)，MMP-9可被多種細胞分泌，尤以巨噬細胞作用最強。本研究通過分析高血糖及血糖波動對巨噬細胞分泌MMP-9的影響，探討血糖波動對糖尿病動脈粥樣硬化的影響及其分子學(xué)基礎(chǔ)。本試驗采用不同的葡萄糖濃度及糖濃度波動干預(yù)巨噬細胞，以此模擬血糖波動的體外模型，利用RT-PCR技術(shù)測定巨噬細胞內(nèi)MMP-9的不同表達，了解高糖及糖波動對MMP-9 mRNA表達的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)及分組

THP-1細胞購自中科院上海細胞生物所細胞中心。用含10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)THP-1至106/ml時換無血清培養(yǎng)基，加PMA(至終濃度為100 nmol/L)，孵育24小時，獲得單核巨噬細胞。

1.2 干預(yù)細胞

配置葡萄糖濃度分別為5 mmol/L、15 mmol/L的1640培養(yǎng)液和相同濃度的甘露醇的1640培養(yǎng)液，第一、二組分別用5 mmol/L和15 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72小時，第三組先用5 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時，然后換15 mmol/L的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)12小時，以此為一個循環(huán)，重復(fù)三個循環(huán)。第四組應(yīng)用甘露醇培養(yǎng)液，換液方式同第三組。

1.3 半定量RT-PCR法測定四組中MMP-9mRNA的表達量

Trizol法提取細胞總RNA,RNA濃度以Nanovue超威量分光亮度計重復(fù)測量3次,A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0,取1.0 μg總RNA為模板，以O(shè)ligo(dT)16為引物按說明書進行逆轉(zhuǎn)錄。MMP-9的引物為：有意義序列引物5’-CCGCA GGGCCCCTTCCTTAT-3’,反義序列引物5’-GCCCACTTGGT CCACCTGGTT-3’，預(yù)計擴增引物全長為438 bp。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)對照，擴增GAPDH引物為：有意義引物序列5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’，下反義序列引物: 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’,預(yù)計擴增引物全長為268 bp,均由Invitrogen公司合成。取5 μl聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳并用BandScan做圖像分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 PMA處理THP-1后細胞形態(tài)的變化

倒置顯微鏡下觀察THP-1細胞可見單核細胞呈圓形半懸浮狀生長，經(jīng)PMA孵育6 h后，細胞形態(tài)開始發(fā)生改變，由懸浮型逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁型，到24 h時基本貼壁，Giemsa染色后見細胞體積增大，形態(tài)多樣，由圓形變?yōu)樗笮?、橢圓形或不規(guī)則形。胞核較小，呈卵圓形或腎形。胞質(zhì)豐富，含有空泡和著色顆粒。

M Marker

1 對照組 2 高糖組

3 甘露醇組 4 糖波動組

圖1 RT-PCR 電泳結(jié)果

2.2 各組細胞內(nèi)MMP-9mRNA的表達

半定量RT-PCR結(jié)果表明，經(jīng)不同培養(yǎng)液干預(yù)后巨噬細胞MMP-9mRNA表達明顯不同，實驗組MMP-9mRNA表達量均明顯高于對照組(P<0.01)，對照組巨噬細胞內(nèi)MMP-9mRNA表達量為(0.531±0.044)，高糖組較對照組明顯增高[(0.627±0.041vs0.531±0.044)，(P<0.01)]；甘露醇組高于高糖組[(0.823±0.036 vs 0.627±0.041),(P<0.01)]；糖波動組高于甘露醇組[(0.897±0.030 vs 0.823±0.036)，(P<0.01)]。

表1 4組間結(jié)果比較

注：與對照組比較，﹡P<0.01；與高糖組比較，﹡﹡P<0.01；與甘露醇組比較，﹡﹡﹡P<0.01。

3 討 論

本試驗采用不同的糖濃度及糖濃度波動培育巨噬細胞，以此模擬血糖波動的體外模型，探討血糖波動及高血糖對巨噬細胞分泌MMP-9的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高糖環(huán)境的干預(yù)下巨噬細胞內(nèi)MMP-9的表達量較對照組明顯增高，而糖波動組MMP-9mRNA表達量較高糖組顯著增加，從細胞水平提示血糖波動與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。

高糖及糖波動使MMP-9分泌增多，分析其原因可能有以下幾個方面：(1)高糖通過激活蛋白激酶C觸發(fā)了氧化應(yīng)激,使對氧化應(yīng)激敏感的核因子-κB(NF-κB)等多種細胞因子激活，啟動了MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄[8]。持續(xù)高糖會使細胞產(chǎn)生慢性適應(yīng)，通過自身反饋調(diào)節(jié)降低或部分消除了高糖毒性，間斷暴露于高濃度葡萄糖環(huán)境下,導(dǎo)致巨噬細胞適應(yīng)能力受損, 氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇，分泌更多的MMP-9。(2) 本實驗還設(shè)計了甘露醇組，甘露醇與葡萄糖分子量十分相近，但是細胞外環(huán)境中的葡萄糖可以進入細胞內(nèi)在多種酶的參與下進行代謝，而甘露醇則很少進入細胞代謝，因此，采用相同濃度的甘露醇以及與波動組相同的方式培養(yǎng)細胞，相當(dāng)于單純模擬了波動組的細胞外滲透壓環(huán)境。結(jié)果甘露醇組巨噬細胞MMP-9 mRNA表達量較高糖組高，較糖波動組低?？紤]高糖及糖波動對巨噬細胞MMP-9 mRNA表達的影響與滲透壓有關(guān)，但滲透壓又不是唯一的影響因素，推測高糖及糖波動增加單核巨噬細胞表達MMP-9mRNA的機制除了滲透壓的改變外還可能存在其他途徑，有待進一步研究證實。

急性心血管事件的發(fā)生多為易損斑塊的破裂。目前許多研究證實，易損斑塊的破裂和MMP-9密切相關(guān)[5]。也有研究表明，在人類硬化性動脈的斑塊肩部及泡沫細胞聚集區(qū)顯示了MMP-9的表達增高，且所有的斑塊抽提物被證實含有MMP-9的活化形式[9,10]。本研究發(fā)現(xiàn)血糖波動導(dǎo)致巨噬細胞分泌更多的MMP-9,提示血糖波動可能會導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定甚至破裂。這提示臨床工作中對糖尿病動脈粥樣硬化患者應(yīng)平穩(wěn)降糖，避免血糖波動過大。

本實驗提示，高糖環(huán)境可以促進巨噬細胞分泌MMP-9，糖波動較高糖更能增加巨噬細胞分泌MMP-9，從而加速AS的形成，造成斑塊的不穩(wěn)定及破裂。提示臨床應(yīng)該平穩(wěn)降糖，減少血糖漂移，真正做到“優(yōu)質(zhì)達標(biāo)”。

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