強(qiáng)化鐵營養(yǎng)對(duì)缺鐵大鼠耳蝸膜性組織actin、myosin、desmin和HSP表達(dá)的影響△

周懷恩 孫愛華 岳波,3 王寶東,4 范靜平 林順漲 鄧月 楊毓梅

1 第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院耳鼻咽喉科(上海 200003)； 2 浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院； 3 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院； 4 濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics) 是從整體水平上研究細(xì)胞、組織或有機(jī)體蛋白質(zhì)組的一門新興學(xué)科，已成為后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的核心內(nèi)容之一。近年來，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在內(nèi)耳疾病研究領(lǐng)域中的應(yīng)用亦不斷取得新進(jìn)展。Robertson等[1]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)cochlin是大鼠和人耳蝸中最豐富的蛋白質(zhì)。Ikezono等[2]用雙向電泳技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，牛的人Coch基因同系物具有獨(dú)特性質(zhì)，是導(dǎo)致遺傳性聾的一個(gè)重要原因。此外，蛋白質(zhì)組和基因組技術(shù)已成功應(yīng)用于毛細(xì)胞再生的體外模型研究[3]。

本課題基于前期對(duì)強(qiáng)化鐵營養(yǎng)影響缺鐵大鼠聽毛細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究成果，應(yīng)用Shotgun蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步深入探討強(qiáng)化鐵營養(yǎng)對(duì)鐵缺乏誘發(fā)感音神經(jīng)性聾大鼠耳蝸膜性組織肌動(dòng)蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)、結(jié)蛋白(desmin)和熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 Z-800原子吸收光譜儀；S-520型電子顯微鏡(日本日立公司)；Mini VE Vertical(GE Amersham) ；UMax Powerlook 2110XL(GE Amersham)；SDS-PAGE: Hofer SE 600(GE Amersham)；scanner: Bio-Rad GS710 scanner(Bio-Rad)；LTQ(Thermo Finnigan, San Jose, CA)；凍干機(jī)；超濾管；超聲機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司SK7200H )；冷凍離心機(jī)(BECKMAN COULTERAllegra X-22R Series Centrifuges )；Mettler Toledo AL104天平；色譜柱：C18柱(15cm×150um，CTI，CA)；Trap柱(Zorbax 300SB-C18 peptide traps，Agilent Technologies, Wilmington, DE)；硫酸亞鐵(北京化學(xué)試劑三廠)；1%戊巴比妥鈉(第二軍醫(yī)大學(xué)藥理教研室提供)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選用體重25～35 g的健康、無耳疾、ABR閾值正常的1～2周齡Wistar大鼠120只(購于中科院上海動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄各半。隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)A組(正常對(duì)照組)20只和預(yù)實(shí)驗(yàn)組(缺鐵組)100只，雌雄分養(yǎng)。A組喂以標(biāo)準(zhǔn)飼料16周；按照國際通用的營養(yǎng)性鐵缺乏大鼠模型復(fù)制方法[4]，以缺鐵飼料飼養(yǎng)動(dòng)物建立缺鐵模型，預(yù)實(shí)驗(yàn)組喂以缺鐵飼料8周后，復(fù)制出至少有一耳ABR閾值改變≥15 dB的大鼠共41只，再將該41只大鼠隨機(jī)分成B組(缺鐵耳聾組)20只和C組(強(qiáng)化鐵治療組)21只，B組繼續(xù)喂以缺鐵飼料8周，C組喂以強(qiáng)化鐵飼料8周。各組動(dòng)物均自由飲用自來水。

1.3 觀察指標(biāo)及方法 三組所有動(dòng)物于喂養(yǎng)前、喂養(yǎng)16周后測(cè)ABR閾值及DPOAE幅值。測(cè)試前用戊巴比妥鈉(25 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，40℃電熱毯保溫。以Madsen公司產(chǎn)SmartEP Manual Version2.1x型ABR測(cè)試系統(tǒng)及Smart OAE Manual Version3.7x型耳聲發(fā)射測(cè)試系統(tǒng)在隔聲室內(nèi)分別測(cè)試ABR閾值(波III反應(yīng)閾)和DPOAE幅值。每次測(cè)試前先檢查外耳道及鼓膜情況，排除外耳道及中耳疾病。

1.4 大鼠耳蝸膜性成分取材 各組大鼠完成ABR和DPOAE測(cè)試后，麻醉下斷頭處死，解剖出雙側(cè)耳蝸，置于DEPC處理的冰冷PBS液(pH=7.45)中，在解剖顯微鏡下剝離骨性蝸殼，取出膜性成分，包括螺旋韌帶、血管紋、基底膜、前庭膜等。以PBS液沖洗血跡，吸干液體后將上述組織一并置于1.5 ml離心管中,置于-40℃冰箱保存，備用。

1.5 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè) ①蛋白提?。簶悠坊瘍龊?用生理鹽水清洗干凈，加入100 μl裂解液[9.5M Urea，4%CHAPS，65mM DTT，2% carrier ampholyte(3-10NL)],羅氏cooktail酶抑制劑，用微量勻漿器將樣品勻漿，再超聲破碎(80 W，8秒8次，間隔15秒，置于冰上)。整個(gè)過程冰浴進(jìn)行。離心14 000 rpm，1小時(shí)，收集上清液。用預(yù)冷的丙酮對(duì)樣品進(jìn)行沉淀，然后用lysis buffer復(fù)溶。②定量：樣品用Bradford法定量， -80℃保存。③電泳：定量后的樣品各取100 μg，加入上樣緩沖液，煮沸5分鐘，離心取上清進(jìn)行上樣，SDS-PAGE電泳使用12.5%的膠(15 mA/膠20 min,30 mA/膠，直至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm)。④染色: 膠體考馬斯亮藍(lán)染色。⑤掃描，獲得圖譜。⑥進(jìn)行膠內(nèi)酶解，最后將酶解液進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，最終得到相應(yīng)的多肽及肽段。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)資料進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物ABR和DPOAE檢測(cè)結(jié)果 動(dòng)物處死后證實(shí)，A、B和C組動(dòng)物中各有8耳患中耳炎，可能影響結(jié)果分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析時(shí)予以剔除。A、B、C三組動(dòng)物分別取32、32和34耳喂養(yǎng)前及處死前檢測(cè)ABR反應(yīng)閾，可見三組動(dòng)物喂養(yǎng)16周后(處死前)ABR反應(yīng)閾均高于喂養(yǎng)前，A組與B組比較，ABR反應(yīng)閾差值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B組與C組比較，ABR反應(yīng)閾差值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 各組動(dòng)物喂養(yǎng)前及喂養(yǎng)16周后(處死前)ABR反應(yīng)閾差

三組大鼠DPOAE幅值檢測(cè)結(jié)果見圖1、2，實(shí)驗(yàn)開始時(shí)A、B、C三組之間平均DPOAE幅值曲線基本一致，各頻率點(diǎn)無明顯差異(P>0.05)； 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)缺鐵耳聾組(B組)較正常對(duì)照組(A組)平均DPOAE幅值在1.4～6 kHz頻率段下降明顯(P<0.05)，僅C組較B組在2、3 kHz頻率段有改善(P<0.05)(圖1、2)。

A—正常對(duì)照組，B—缺鐵耳聾組，C—強(qiáng)化鐵治療組，Z —本底噪聲

A—正常對(duì)照組，B—缺鐵耳聾組，C—強(qiáng)化鐵治療組，Z —本底噪聲

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)結(jié)果 B組與A組比較：B組大鼠耳蝸膜性組織中的actin、myosin及HSP種類較A組減少，并出現(xiàn)特異蛋白質(zhì)desmin。C組與B組比較：經(jīng)強(qiáng)化鐵營養(yǎng)治療后，C組耳蝸膜性組織中的myosin和HSP種類較B組增加，但actin種類未見明顯改變，而desmin消失了。質(zhì)譜檢測(cè)actin、myosin、HSP結(jié)果顯示：在A組檢測(cè)到的alpha cardiac-Actin,aortic smooth muscle-Actin,B、C組兩組都消失，質(zhì)譜檢測(cè)到B組的第306個(gè)為“desmin”蛋白，在A組和C組內(nèi)沒有出現(xiàn)(表2)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)研究表明，缺鐵誘發(fā)耳聾可使大鼠ABR閾值提高，DPOAE幅值下降、引出率降低或消失[5]。本實(shí)驗(yàn)中，鐵缺乏大鼠ABR閾值提高顯著，DPOAE幅值在1.4～6 kHz頻率段明顯下降，表明缺鐵耳聾動(dòng)物模型復(fù)制可靠。由于耳蝸膜性組織中的蛋白質(zhì)近1 000個(gè)，難以對(duì)每個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行差異分析，故實(shí)驗(yàn)中僅分析耳蝸膜性組織中actin、myosin、desmin和HSP的差異表達(dá)。

actin在耳蝸中主要存在于聽毛細(xì)胞靜纖毛、表皮板及皮板下網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)外柱細(xì)胞、Deiter支持細(xì)胞及基底膜中甚為少見，不同動(dòng)物內(nèi)耳中的分布存在細(xì)微差異。目前研究表明，老年性聾、藥物性聾、噪聲性聾、爆震性聾、缺鐵性聾等感音神經(jīng)性聾與耳蝸內(nèi)actin變化密切相關(guān)，當(dāng)細(xì)胞接受細(xì)胞外信號(hào)的作用時(shí)，actin可發(fā)生聚合或解聚，而actin的聚合與解聚直接導(dǎo)致耳蝸螺旋器中actin絲的變化[5～7]。Tilney[6]觀察噪聲致聾后恢復(fù)11天時(shí)的蜥蜴耳蝸，發(fā)現(xiàn)靜纖毛中actin絲原有構(gòu)象被破壞，靜纖毛長毛中近表皮板部actin絲解聚，造成其韌性降低，功能受損，從而產(chǎn)生聽覺障礙，提示該區(qū)域易受損傷的原因與其中的actin構(gòu)象變化有關(guān)。近年來應(yīng)用高通量的基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)鐵缺乏導(dǎo)致的actin變化在基因轉(zhuǎn)錄水平就已經(jīng)開始，說明肌動(dòng)蛋白mRNA表達(dá)量的減少是actin減少的主要因素之一[7]。本研究結(jié)果表明，鐵缺乏可導(dǎo)致actin降解或解聚或構(gòu)象改變，從而損傷聽毛細(xì)胞、內(nèi)外柱細(xì)胞、Deiter支持細(xì)胞及基底膜細(xì)胞，同時(shí)也說明了缺鐵誘發(fā)耳聾大鼠耳蝸actin構(gòu)象的改變是在蛋白質(zhì)翻譯這個(gè)層面才開始的。但強(qiáng)化鐵營養(yǎng)并未使actin增加，也就是說，單純的鐵劑治療對(duì)于缺鐵導(dǎo)致的actin降解或解聚可能沒有恢復(fù)作用，但是增加鐵劑恢復(fù)了整體的代謝機(jī)制，加強(qiáng)了耳蝸內(nèi)的解毒機(jī)制，使含鐵酶等蛋白質(zhì)代謝狀況得到改善，在一定程度上使缺鐵誘發(fā)的耳聾得到恢復(fù)。

肌球蛋白在內(nèi)耳結(jié)構(gòu)的形成和構(gòu)建中起著重要作用。如myosinIC是聽毛細(xì)胞的適應(yīng)性裝置，最近發(fā)現(xiàn)[8]myosinIC通過IQ區(qū)域與毛細(xì)胞上的受體結(jié)合并相互作用，這個(gè)過程受鈣調(diào)蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)；myosinⅥ位于富含actin的內(nèi)耳毛細(xì)胞靜纖毛根部與表皮板交接處，它的功能是穩(wěn)定靜纖毛基底的連接；myosinⅦA分布遍及整個(gè)毛細(xì)胞，參與維持靜纖毛結(jié)構(gòu)完整性以及內(nèi)耳毛細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程，并且與靜纖毛積聚成束和維持靜纖毛的硬度有關(guān)[9]。myosin XV分布在哺乳動(dòng)物耳蝸和前庭毛細(xì)胞靜纖毛的頂部，它對(duì)于形成并維持靜纖毛結(jié)構(gòu)，以及靜纖毛階梯狀的生長分布起重要作用[10]。myosinⅢ在感覺神經(jīng)上皮中表達(dá)，在內(nèi)耳中于外毛細(xì)胞表達(dá)，它主要有運(yùn)動(dòng)和蛋白激酶的功能，對(duì)細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)起一定作用[11，12]，其編碼基因突變是導(dǎo)致遺傳性聾的重要原因[13～17]。本文表2可以看出，myosin在缺鐵耳聾組也是減少的， 可能提示鐵缺乏對(duì)此類細(xì)胞的骨架形成都具有抑制作用，或者鐵缺乏加速了細(xì)胞骨架的降解。

表2 各組耳蝸膜性組織質(zhì)譜檢測(cè)到actin、myosin、HSP的種類

而經(jīng)強(qiáng)化鐵營養(yǎng)后，mysion種類和數(shù)量明顯增加，延緩細(xì)胞骨架的降解，從而有助于恢復(fù)耳蝸內(nèi)細(xì)胞骨架的完整性。

本研究缺鐵耳聾組大鼠耳蝸出現(xiàn)了desmin(結(jié)蛋白)表達(dá)，而在強(qiáng)化鐵治療后又消失，似與內(nèi)耳鐵代謝調(diào)整狀態(tài)有關(guān)，具體機(jī)理與意義值得探討。desmin 于1976年被命名，分子量為52～53 kDa，是骨骼肌、平滑肌和心肌中主要的中間纖維蛋白。desmin連接于z線之間，而使單個(gè)肌原纖維連接起來，將收縮運(yùn)動(dòng)機(jī)械地整合在一起，同時(shí)也連接線粒體、細(xì)胞核、肌漿網(wǎng)、致密斑、橋粒和其它細(xì)胞器。采用同種再重組方法使鼠desmin基因進(jìn)行無效突變，發(fā)現(xiàn)敲除desmin基因鼠生長正常且多產(chǎn)，但是這些鼠又被證明為多系統(tǒng)紊亂[18～21]。結(jié)蛋白可以作為成肌纖維母細(xì)胞的標(biāo)志[22]， 結(jié)蛋白和alpha平滑肌肌動(dòng)蛋白在腎小球和間質(zhì)纖維化中表達(dá)增強(qiáng)[23]。因而推測(cè)，缺鐵誘發(fā)耳聾導(dǎo)致耳蝸組織的成肌纖維母細(xì)胞生長，活性增強(qiáng)，從而出現(xiàn)了desmin的表達(dá)，引起耳蝸出現(xiàn)了纖維化的傾向，從而導(dǎo)致耳蝸損傷引起聽功能障礙。強(qiáng)化鐵治療后，減緩或恢復(fù)了耳蝸纖維化的傾向，從而有助于聽功能的改善或恢復(fù)。

本研究另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是，HSP在缺鐵誘發(fā)耳聾和補(bǔ)充強(qiáng)化鐵營養(yǎng)過程中的變化非常明顯。HSP為機(jī)體內(nèi)一種重要的蛋白質(zhì)，可顯著提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，能較強(qiáng)地穩(wěn)定細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)而對(duì)抗應(yīng)激氧化[16，17]。外界環(huán)境快速變化，如遇熱等，以及細(xì)胞快速生長與分化時(shí)，如胚胎分化、炎癥等HSP表達(dá)會(huì)明顯增加。有作者[18]認(rèn)為HSP可維持抗氧化酶的活性，增強(qiáng)其清除氧自由基作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，大鼠在缺鐵誘發(fā)耳聾的情況下HSP生成障礙，既造成了氧自由基清除作用的障礙，也影響了細(xì)胞內(nèi)其它蛋白質(zhì)的合成、利用與運(yùn)送，使其它蛋白質(zhì)的含量減少(如肌動(dòng)蛋白等)，使耳蝸內(nèi)靜纖毛等細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定作用降低，使細(xì)胞的凋亡速度加快、結(jié)構(gòu)改變、功能降低，從而發(fā)生耳聾。而強(qiáng)化鐵營養(yǎng)可使熱休克蛋白種類和數(shù)量明顯增加，從而減緩耳蝸內(nèi)細(xì)胞凋亡速度，有助于聽力恢復(fù)。

1 Robertson NG,Cremers CW,Huygen PL,et al.Cochlin immunosta ining of inner ear pathologic deposits and proteomic analysis in DFNA9 deafness and vestibular dysfunction[J].Hum Mol Genet,2006,15:1 071.

2 Ikezono T,Omori O,Ichenose S,et al.Identification of the protein product of the Coch gene (hereditary deafness gene) as the major component of bovine inner ear protein[J].Biochim Biophys Acta,2001,1 535:258.

3 周懷恩，孫愛華. 蛋白質(zhì)組學(xué)及在耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)中的應(yīng)用[J].中國耳鼻咽喉顱底外科雜志,2007,13:477.

4 李津嬰,孫愛華.缺鐵性貧血大鼠模型復(fù)制及觀察[J].上海醫(yī)學(xué)，1991,14：88.

5 Hu BH,Henderson D. Changes in F-actin labeling in the out hair cell in the follow noise exposure[J] .Hear Res,1997,110:209.

6 Tilney LG,Saunder JC,Egelman E,et al. Changes in the organization of actin filaments in the stereocilia of noise-damaged lizard cochleae[J] Hear Res, 1982,21：181.

7 孫愛華，田樹昌,王秋莎,等.強(qiáng)化鐵營養(yǎng)對(duì)鐵缺乏大鼠耳蝸膜性結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的影響[J].聽力學(xué)及言語疾病雜志，2007,15:299.

8 Cyr JL，Dumont RA，Gilespie PG．Myosin-1c interacts with hair cell receptors through ites calmodulin—binding IQ domains[J].J Neurosc，2002，22：2 487.

9 Hasson T． Unconventional myosins．The basis for deafness in mouse and man[J]．Am J Hum Genet，1997，61：801.

10 Belyantseva IA，Boger ET，F(xiàn)riedman TB．Myosin XVa localizes to the tips of inner ear sensory cell stereocilia and is essential for stail ease formation of the hair bundle[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2003,100：13 958.

11 Komaba S，Inane A，Maruta S，et al．Determination of human myosin III as a motor protein having a protein kinase activity[J].J Biol Chem，2003，278：21 352.

12 Dose AC，Burnside B．Cloning and chromosomal localization of a human class III myosin[J].Genomics，2000，67：333.

13 Donaudy F，Snoeckx R，Pfister M，et al． Nonmuscle myosin heavy chain gene MYH14 is expressed in coc hlea and mutated in patients affected by autosomal dominant hearing impairment(DFNA4) [J]． Am J Hum Genet，2004，74：770.

14 Melchionda S，Ahituv N，Bisceglia L，et al．MYO6，the human homologue of the gene responsible for deafness in snell's waltzer mice，is mutated in autosomal dominant nonsyndromic hearing ioss[J]．Am J Hum Genet，2001，69：635.

15 Ahmed ZM，More IL，Riazuddin S，et al．Mutations of MY06 are as-sociated with recessive deafness，DFNB37[J]．Am J Ham Genet，2003，72：1 315.

16 Redowicz MJ．Myosins and deafness[J]．J Muscle Res Cell Motil,1999，20：241.

17 Lalwani AK，Goldstein JA，Kelley MJ，et al．Human nonsyndromic hereditary deafness DFNA17 is due to a mutation in nonmuscle myoin MYH9[J]．Am J Hum Genet，2000，67：1 121.

18 Yu Y, Szczepek AJ, Haupt H, et al．Geldanamycin induces production of heat shock protein 70 and partially attenuates ototoxicity caused by gentamicin in the organ of Corti explants[J]. J Biomed Sci,2009,16:79.

19 Taleb M, Brandon CS, Lee FS, et al．Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death[J]. Cell Stress Chaperones,2009,14:427.

20 Kukreja RC, Hess ML. The oxygen free radical system: from equations through membrane-protein interactions to cardiovascular injury and protection[J]. Cardiovascular Research, 1992,26:641.

21 Milner DJ，Weitzer G, Tran D, et al．Disruption of muscle architecture and myocardial degeneration in mice lacking desmin[J]．The Journal of Cell Biology，1996，134：1 255.

22 Jimenez Heffernan JA, Aguilera A, Aroeira LS,et al.Immunohistochemical characterization of fibroblast subpopulations in normal peritoneal tissue and in peritoneal dialysis-induced fibrosis[J]. Virchows Arch,2004,444: 247.

23 Van den Branden C, Ceyssens B, De Craemer D,et al. Renal antioxidant enzymes and fibrosis-related markers in the rat adriamycin model[J]. Nephron, 2000,86:167.