豚鼠耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法的改良與觀察

蔡琴芳 蔣立新

耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法是耳科學(xué)基礎(chǔ)研究和內(nèi)耳疾病研究應(yīng)用較廣泛的的一種方法，其特點(diǎn)是染色后毛細(xì)胞及其表面纖毛顯示清晰且易于觀察和計(jì)數(shù)等[1]。但該方法在鋪片過(guò)程中存在一些難點(diǎn)和不穩(wěn)定因素，如硝酸銀染色不均勻，基底膜剝離不完整等。本研究在常規(guī)耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法的基礎(chǔ)上提出一些改進(jìn)，取得了比較滿意的觀察效果，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑與材料 試劑：0.5%硝酸銀、蒸餾水和10%甲醛。材料：止血鉗、眼科剪、小尖鑷、小剝離子、1毫升注射器、玻璃皿、離心管、解剖顯微鏡和電子顯微鏡。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重250～300 g、耳廓反射靈敏的健康白色紅目豚鼠20只，隨機(jī)分為對(duì)照組10只，用常規(guī)方法行基底膜硝酸銀染色，改良組10只，用改良法行基底膜硝酸銀染色。

1.3基底膜硝酸銀染色鋪片

1.3.1取材 每組動(dòng)物迅速斷頭后即刻經(jīng)顱骨背側(cè)快速取出雙側(cè)聽(tīng)泡。

1.3.2灌注染色 小號(hào)止血鉗咬開(kāi)聽(tīng)泡，暴露耳蝸，修剪掉耳蝸周圍多余的的骨壁，在解剖顯微鏡下放大10倍，用1毫升注射器針頭在蝸尖處挑開(kāi)小孔，挑開(kāi)圓窗膜，去除鐙骨，使耳蝸的前庭階和鼓階開(kāi)放后，抽取0.5%硝酸銀溶液，經(jīng)蝸?lái)斝】拙徛嘧?，每只耳蝸約灌注2～3 ml，然后抽取蒸餾水同法灌注以沖洗耳蝸，一般2次即可。

1.3.3固定還原 用1毫升注射器抽取10% 中性福爾馬林固定液同法灌注耳蝸3 次，再放入10% 中性福爾馬林固定液，將標(biāo)本保留在 4℃冰箱內(nèi)繼續(xù)固定還原4小時(shí)。

1.3.4曝光顯色 對(duì)照組固定后的耳蝸標(biāo)本置放于100 W的白熾燈下，距離光源10 cm，曝光1小時(shí)[2]。改良組則先去掉蝸殼，取出蝸軸，置于10%福爾馬林溶液中直接曝光。具體操作方法如下：將固定還原后的耳蝸標(biāo)本移入盛有蒸餾水的玻璃皿中，在解剖顯微鏡下放大10倍，用小尖鑷從開(kāi)放的圓窗進(jìn)入鼓階，沿鼓階走向撬開(kāi)基底回的蝸殼，然后順勢(shì)向上以“脫帽”方式,將蝸殼連同螺旋韌帶輕輕取下，保留完整的基底膜附著于蝸軸的骨螺旋板邊緣[3]。用小剝離子于底回的下方將蝸軸切斷后，小尖鑷細(xì)心夾起并放入盛有10% 中性福爾馬林固定液的透明離心管中，置放于100 W的白熾燈下，距離光源10 cm，10分鐘左右后標(biāo)本即可變?yōu)樽睾稚缓筮M(jìn)行下一環(huán)節(jié)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5基底膜剝離 對(duì)照組因耳蝸尚藏于蝸殼內(nèi)，首先使用鏟刀把耳蝸底部骨壁鏟磨平整，使耳蝸呈直立狀態(tài)。將靠近顳骨巖部一側(cè)的厚骨壁鏟薄，鏟至隱約可見(jiàn)深褐色的螺旋韌帶時(shí)為止。用分離針小心地將蝸殼骨壁輕挑下來(lái)，由蝸尖向蝸底逐步分離，然后用尖細(xì)的油絲鑷子輕輕地撕下螺旋韌帶、前庭膜及蓋膜，最后從蝸尖向蝸底逐步地把盤繞在寶塔形耳蝸軸外緣上的基底膜小心取下[4]。改良組標(biāo)本在曝光程序中已經(jīng)去除了蝸殼及螺旋韌帶，保留完整的基底膜附著于蝸軸的骨螺旋板邊緣。將棕褐色蝸軸轉(zhuǎn)入盛有蒸餾水的玻璃皿內(nèi)后，用尖鑷固定蝸軸，以1毫升注射器針頭從底回向頂回逐步剝離，即可快速取下完整的基底膜，用針頭和小尖鑷輕輕地分離并撕下前庭膜與蓋膜。

1.3.6鋪片 小剝離子將耳蝸基底膜按螺旋轉(zhuǎn)數(shù)切成四段后一一移放到清潔載玻片上，用濾紙吸干，在上面點(diǎn)一滴純甘油。然后在解剖顯微鏡下檢查、調(diào)整標(biāo)本，保證正面朝上，鋪放平整，放上蓋玻片，周圍用中性樹(shù)膠封固，在高倍顯微鏡下觀察并攝片。

2 結(jié)果

兩組動(dòng)物耳蝸基底膜均完整剝離，對(duì)照組曝光需1小時(shí)，改良組曝光僅需10分鐘且操作更加簡(jiǎn)便，平均每個(gè)標(biāo)本的鋪片過(guò)程耗時(shí)較對(duì)照組約少一個(gè)小時(shí)。對(duì)照組可清晰地顯示內(nèi)外毛細(xì)胞及其表面纖毛簇(圖1)，改良組亦可清晰顯示內(nèi)外毛細(xì)胞及其表面纖毛簇，可見(jiàn)三排外毛細(xì)胞和一排內(nèi)毛細(xì)胞，排列整齊，外毛細(xì)胞表面聽(tīng)纖毛呈現(xiàn)V字形，內(nèi)毛細(xì)胞表面聽(tīng)纖毛呈現(xiàn)弓字形(圖2)。

3 討論

耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法可直接觀察毛細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，目前較常用的耳蝸基底膜硝酸銀染色鋪片法[5],主要步驟是取材、灌注染色、固定還原、曝光顯色、剝離與鋪片，本實(shí)驗(yàn)主要在曝光顯色及基底膜剝離方法上進(jìn)行了改進(jìn)。在常規(guī)基底膜硝酸銀染色鋪片技術(shù)中，染色過(guò)程中基底膜藏于蝸殼內(nèi)，容易造成曝光不夠，染色不均等，因此，有人強(qiáng)調(diào)要在日光直射下或者置于100 W的白熾燈下曝光1小時(shí)[2]。本實(shí)驗(yàn)改良組選擇先去掉蝸殼，經(jīng)硝酸銀灌流浸潤(rùn)的基底膜可直接暴露在光線下，染色直觀，顯色亦更加均勻穩(wěn)定。因?yàn)橹苯悠毓馊旧ú恍枰獜?qiáng)烈的光線，如果條件不允許，可不需特意準(zhǔn)備光源，自然曝光至標(biāo)本變?yōu)樽睾稚纯桑瑢?shí)驗(yàn)更加簡(jiǎn)便可行。常規(guī)基底膜硝酸銀染色鋪片技術(shù)，因蝸軸尚附著于耳蝸底部骨壁，基底膜的剝離一般是由蝸尖向蝸底依次進(jìn)行[4]，而在本實(shí)驗(yàn)中，蝸軸已完全從耳蝸先分離出來(lái)，采用逆向剝離法——從底回向頂回逐步連續(xù)剝離，可快速、順利、完整地取下基底膜。文中結(jié)果顯示，改良法耳蝸基底膜剝離完整，毛細(xì)胞和聽(tīng)纖毛顯色清晰，但所需時(shí)間較對(duì)照組少，說(shuō)明改良硝酸銀染色鋪片法操作簡(jiǎn)便，易于掌握，鋪片效果滿意，值得推廣使用。

圖1 對(duì)照組耳蝸基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞及其表面纖毛簇顯示清晰(×200)圖2 改良組耳蝸基底膜內(nèi)外毛細(xì)胞及其表面纖毛簇顯示清晰(×200)

4 參考文獻(xiàn)

1 李虹,紀(jì)旭,姜學(xué)鈞.甲磺酸去鐵胺抗丁胺卡那霉素耳毒性作用及機(jī)理研究[J]. 中華耳科學(xué)雜志, 2008,6:157.

2 童素琴. 豚鼠耳蝸硝酸銀浸潤(rùn)法曝光的改良[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào), 1989 , 8: 49.

3 阮芳銘,高文元,王海明,等.全耳蝸基底膜硬鋪片法的改進(jìn)和組化觀察[J]. 海軍醫(yī)學(xué)雜志, 2002,23:151.

4 韓素秀,宋學(xué)政,尹嘉才.耳蝸鋪片硝酸銀染色法的改進(jìn)與觀察[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1997, 3: 74.

5 丁大連, 郭毓卿, 羅德峰,等. 豚鼠全內(nèi)耳終器硝酸銀染色法[J].上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1989, 9: 327.