喉移植免疫學研究進展

馬瑞娜 綜述 崔鵬程 審校

喉全切除后理想的重建方法是喉移植。早在1965年就有關于狗喉再植模型的研究。1969年，Klausken等對一位喉癌患者施行部分喉移植術，手術本身是成功的，患者術后在恢復發(fā)聲、呼吸、吞咽功能的同時也取得了較好的美容效果，但術后8個月患者死于腫瘤復發(fā)。在隨后的20年中由于技術和免疫排斥問題以及倫理學的爭論，使喉移植的發(fā)展落后于其它實質(zhì)性臟器的移植。近年來隨著免疫生物學的發(fā)展及免疫抑制劑的研究，喉移植逐漸成為患者改善生活質(zhì)量的迫切需求。1998年Strome等[1]完成了人類歷史上第一例喉移植，該患者在隨后7年多能正常吞咽，發(fā)聲基本正常，頸部外觀美容效果好，有較高的生活質(zhì)量[2]。喉移植無論在發(fā)聲、呼吸、美容、生活質(zhì)量等方面均優(yōu)于目前喉全切除后的其它重建方法。然而由于人喉黏膜不僅血運豐富,而且富含免疫組織及免疫細胞,移植后的排斥反應始終是一個難題。本文就喉移植免疫學方面的研究進展作一綜述。

1 喉移植免疫調(diào)節(jié)

1.1喉的免疫原性 近年來對人[3～5]以及實驗動物[6，7]的研究表明喉包含有免疫組織，這種組織以喉相關性淋巴上皮濾泡的形式存在，其表達與年齡和疾病相關，并呈彌散分布，這種免疫結構對外界環(huán)境的變化反應迅速。在對大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)病毒、細菌及其誘導的變態(tài)反應均可引起這種免疫組織快速反應，導致樹突狀細胞大量增殖[8，9]。同種異體移植物存活的關鍵主要依賴于供體主要組織相容性抗原復合物(major histocompability complex，MHC)的表達，供體的淋巴細胞、樹突狀細胞等具有豐富的MHCⅠ、Ⅱ類抗原，是主要的致敏原，排斥反應發(fā)生的快慢和嚴重程度取決于供、受體組織相容性的匹配程度[10]。Rees等[5]通過免疫熒光技術檢測人的喉黏膜，結果顯示喉的上皮組織及黏膜含有MHC抗原，并認為喉黏膜具有免疫活性，可能會引起喉移植急性排斥反應。Edward等[11]研究發(fā)現(xiàn)人喉的人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)在各種組織中分布不同，人喉的黏膜層高表達HLAI，中度表達HLAⅡ；黏膜下腺層高表達HLAⅡ，中度表達HLAI；甲狀軟骨和甲狀腺中僅高表達HLAI；在軟骨膜和雪旺細胞中均可見HLAI和HLAⅡ表達，但HLAI表達強于HLAⅡ；軟骨基質(zhì)、肌細胞、神經(jīng)軸突既不表達HLAI也不表達HLAⅡ。MHCⅡ是啟動免疫排斥的主要抗原，在喉組織中主要分布在黏膜上皮層、黏膜下腺、血管、軟骨膜和雪旺細胞。根據(jù)淋巴細胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)及功能的不同將淋巴細胞分為若干亞群，在免疫排斥中，MHCI和 MHCⅡ抗原都需要CD4的參與，CD8在被活化前由CD8與CD4共同識別抗原遞呈細胞表面的異體的MHC[12]，CD8+T細胞的T細胞受體/CD3復合物(TCR/CD3)識別外來抗原與MHCI類抗原(多肽部分)的復合物，介導細胞毒性T細胞對抗原進行排斥。 CD4+T細胞中的TCR/CD3識別外來抗原與MHCⅡ類抗原(多肽部分)的復合物，激活TH1和TH2細胞，使巨噬細胞和B細胞活化。樹突狀細胞是最重要的抗原遞呈細胞(antigen presenting cell，APC)，具有強烈的激活T細胞的能力，這些細胞分散在除了腦組織和角膜之外的全身各個組織中，是全身免疫系統(tǒng)的監(jiān)視細胞，在移植后的排斥反應中具有重要作用。Jecker 等研究表明大鼠的APC 主要存在于喉黏膜上,這一結論在其他實驗動物如豬的實驗研究中也得到證實[7,13]。Friedman等[14]發(fā)現(xiàn)樹突狀細胞主要存在于上皮細胞中，喉上皮組織中樹突狀細胞的分布密度最高，上皮下層樹突狀細胞的密度僅為上皮層的25%。除了聲門處密度較低以外，樹突狀細胞沿著喉氣管下行，密度逐漸增高，軟骨組織中沒有樹突狀細胞的分布，喉的非黏膜組織與黏膜組織相比僅具有很低密度的樹突狀細胞，喉的黏膜組織是免疫排斥反應的靶細胞。在一些器官移植的實驗中發(fā)現(xiàn)，組織缺血再灌注后會引起主要組織相容性抗原表達上調(diào)，從而會增加移植物的免疫原性[15]。Barker等[13]在對豬的喉移植模型的研究中發(fā)現(xiàn)聲門上區(qū)缺血再灌注后免疫活性細胞數(shù)量減少，聲門下區(qū)缺血再灌注后免疫活性細胞的數(shù)量明顯增多。總之，在不同樣本間免疫細胞活性的表達更取決于個體的差異性而不是以上所說的這些部位改變。因此，這種發(fā)現(xiàn)的生物學意義也受到了質(zhì)疑。

1.2免疫排斥反應的分級和標志 Strome等[16]研究的喉移植模型不僅包括喉，還包括甲狀腺、甲狀旁腺等。早在1992年，他們對大鼠喉移植模型的研究發(fā)現(xiàn)喉急性免疫排斥反應一般開始于術后24小時，最早是黏膜水腫、白細胞滲出，接著是大量淋巴細胞滲出，進行性的上皮組織、腺體、肌肉以及骨骼破壞，14天后移植喉出現(xiàn)完全的破壞，最終被肉芽組織取代。Lorenz等[17]將大鼠喉移植后免疫排斥按照移植的時間和供體喉植入后不同組織的變化分為未見排斥(24小時內(nèi))、輕度排斥(3天)、中度排斥(5～7天)、中重度排斥(9～12天)、重度排斥(15～20天)5個等級。在對同種異體移植喉樣本的各種組織結構進行分析后發(fā)現(xiàn)上皮組織的排斥反應最明顯，移植后1周左右即有大部分復層上皮已經(jīng)排斥得只剩單層上皮，而到15～20天時，已經(jīng)檢測不到上皮組織；肌肉組織是另一類免疫排斥較明顯的組織，肌肉在移植后1周左右即已經(jīng)排斥掉一半，而在15～20天時已完全缺失；小唾液腺在移植后1天即發(fā)生水腫，5～7天左右發(fā)生萎縮，而7～10天時已經(jīng)完全被排斥掉；淋巴濾泡在移植后3天少有腫脹，5～7天時較明顯，9～12天時體積變??；甲狀腺在移植3天時已開始發(fā)生排斥反應，5～7天時已經(jīng)被排斥掉一半以上，9～12天后已經(jīng)完全被排斥掉；軟骨膜的免疫排斥反應較以上組織弱，在9～12天時仍有大部分軟骨膜存在，而15～20天時還有一半軟骨膜存在；軟骨的免疫原性是最弱的，在9～12天時未發(fā)生免疫排斥反應，軟骨結構正常，15～20天時僅有少量軟骨組織減少，大部分結構仍存在。Nelson等[18]將甲狀旁腺素(parathyroid hormone ，PTH)作為免疫排斥的生物學標志，根據(jù)Strome等[16]研究的喉移植模型，在大鼠同種異體移植術前對受體實施甲狀旁腺切除術，移植術后24小時發(fā)現(xiàn)受體體內(nèi)甲狀旁腺素重新達到標準化水平，并且隨著免疫排斥的進行開始下降，甲狀旁腺組織學的變化與移植喉組織免疫排斥反應組織學的變化相一致，因此認為，PTH可以作為喉移植急性排斥反應的生物學標志。陳剛等[19]在對大鼠喉移植的研究中發(fā)現(xiàn)移植組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)及白細胞介素10(interleukin 10, IL-10)表達水平的變化與排斥反應的密切程度相關，TNF-α是介導喉移植術后急性排斥反應的重要細胞因子；IL-10在喉移植免疫耐受中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。TNF-α能有效地反映免疫排斥反應的程度，而IL-10則是反映免疫耐受的有效指標。TNF-α及IL-10能夠反映移植組織排斥反應進程的變化。

2 降低免疫排斥的對策

理想的降低移植排斥措施是進行同基因型喉移植，在MHC配型吻合的人群中進行移植有諸多優(yōu)越性，但尋找MHC配型吻合的供體較為困難，限制了其臨床應用。常用的降低免疫排斥的措施有：應用免疫抑制劑，誘導受體免疫耐受，降低喉的免疫原性。

2.1免疫抑制劑的應用 限制喉移植臨床應用的主要問題是免疫抑制劑的使用，尋求一種既能誘導免疫耐受同時副作用又小的免疫抑制劑是今后的發(fā)展方向之一。環(huán)胞素A(cyclosporin A，CsA)的應用開創(chuàng)了抑制排斥反應的新局面。由于CsA 有效地抑制了抗體和細胞介導的免疫反應及慢性炎癥，已成為免疫抑制療法的主要用藥。Strome[16]通過應用CsA對大鼠同種異體喉移植的研究表明，CsA應用劑量與移植物的組織學變化成負相關。CsA用量小(5 mg-1·kg-1·d-1)時, 移植喉的組織學表現(xiàn)為中到重度排斥反應;CsA劑量為7.5 mg-1·kg-1·d-1時,組織學表現(xiàn)為輕到中度排斥反應;應用大劑量CsA(10 mg-1·kg-1·d-1)的組織學僅表現(xiàn)為炎性細胞浸潤, 黏膜和黏膜下腺體結構形態(tài)基本正常,說明CsA有抑制喉同種異體移植免疫排斥反應的作用。CsA的主要副作用是腎毒性，類固醇能夠減少環(huán)胞霉素A到2 mg/kg,在減少CsA用量的同時減小了CsA的副作用，而免疫抑制作用未受明顯影響[20]。Berke等(1965)在對犬進行同種異體喉移植的實驗中,將CsA、硫唑嘌呤、甲基強的松和強的松聯(lián)合應用，證實可延長動物存活時間，聲帶功能恢復良好，組織學檢查基本正常。Nelson等[21]將他可莫林單獨或與麥考酚脂聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)麥考酚脂能夠提高他可莫林的耐藥性，同時減少他可莫林的劑量。Akst等[22]將他莫克林與抗T細胞α、β受體的單克隆抗體聯(lián)用，持續(xù)5天，結果10例大鼠中有8例在術后的100天內(nèi)在組織學上未出現(xiàn)強烈的免疫排斥，但是100天后，受體的免疫系統(tǒng)逐漸恢復，發(fā)生排斥反應。Khariwala等[23]在這種受體出現(xiàn)免疫恢復的時候，再次應用上述短期沖擊療法，取得了滿意的效果。這種短期應用免疫抑制劑方法的好處在于避免了長期應用所產(chǎn)生的副作用。

2.2誘導移植物的免疫耐受 誘導嵌合體形成是最古老的誘導免疫耐受的方法。嵌合狀態(tài)即兩種來源不同的細胞群在一個機體內(nèi)共同存在的狀態(tài)，對移植物的長期存活具有重要意義。供體骨髓輸注移植術已經(jīng)被成功的應用于人的實質(zhì)臟器移植以提高受體的嵌合狀態(tài)。在大鼠喉移植中，Khariuala等[24]對移植術后靜脈輸注骨髓和在喉移植同時接受同一供體血管化骨移植這兩種方法進行研究，雖然兩種方法喉移植術后受體存活均可超過180天，但均未能檢測到嵌合體，血管化骨移植組混合淋巴細胞檢測并沒有顯示特殊的免疫耐受，嵌合狀態(tài)小于1%。這種結果與實質(zhì)臟器移植結果不同，可能是免疫抑制劑應用時間的限制尚未使受體外周血中形成供體細胞。雖然目前其他領域已有臨床應用嵌合體誘導免疫耐受的經(jīng)驗,但仍需進一步研究其可行性及建立成熟的評價體系。

2.3降低移植喉的免疫原性 喉是由甲狀軟骨、環(huán)狀軟骨、杓狀軟骨、肌肉、黏膜和關節(jié)等構成的復合組織器官，具有很強的免疫原性，采用直接的同種異體移植術必然會引起強烈的免疫排斥反應，最終導致移植的失敗，而大量使用免疫抑制劑會造成原有腫瘤復發(fā)或者轉(zhuǎn)移，多重感染等嚴重后果(Lepold,1983)。 Barthel等[25]認為在移植前對供體喉進行7.34 Gy 左右的體外照射,可減少環(huán)孢素的用量,有一定的免疫抑制作用。但Lorenz等[20]認為對移植喉進行體外照射只是增加了受體對免疫抑制劑的攝取，并未降低移植物的免疫原性。也有學者認為移植前對受體進行預防性照射,可顯著減少移植后的排斥反應[26]。通過組織工程技術獲得異體的少量組織，在實驗中經(jīng)過滅菌、消化、分離、培養(yǎng)等可降低免疫排斥反應，如Yamashita等[27]利用聚丙烯網(wǎng)復合豬皮膚膠原基質(zhì),成功修補犬的半喉，Xu等[28]通過高滲鹽、核酸酶消化及乙醇脫水處理后制備出牛聲帶細胞外基質(zhì)，侯楠等[29]運用灌注法制備出了兔低免疫原性全喉支架，這種支架在保留了軟骨活性的同時提供了較完整的去細胞全喉支架,但其應用于臨床還需進一步的研究。

隨著器官移植學的飛速發(fā)展，非生命必須器官的移植受到人們的重視，盡管喉移植的免疫抑制方法還有待進一步完善，但是隨著該領域研究的不斷深入，喉移植將成為人類治療喉全切除術后喉功能重建的新選擇。

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