胚胎干細胞向內(nèi)耳細胞誘導分化的研究進展*

李利 趙立東 綜述 邢光前 楊仕明 審校

胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)可在體外無限增殖，且保持其未分化狀態(tài)，但在特定環(huán)境下可以被誘導分化為各種組織細胞。近年來，國內(nèi)外眾多學者致力于將ESCs誘導分化為內(nèi)耳細胞并進一步治療耳聾的研究。本文就目前ESCs特性、分化途徑、方法以及相關的研究成果做一綜述。

1 胚胎干細胞

ESCs是一個具有自我更新和多分化潛能的特定細胞群。在胚胎發(fā)育的早期(受精后5～7天)即囊胚期階段，出現(xiàn)了兩種不同的細胞類型：包繞在外形成囊腔壁的外胚滋養(yǎng)層細胞，將來發(fā)育形成胎盤；位于囊腔內(nèi)的內(nèi)細胞團，將來發(fā)育形成胚胎。內(nèi)細胞團經(jīng)體外培養(yǎng)就成為ESCs。1981年，Evans等從鼠的囊胚中分離出內(nèi)細胞團，成功地建立了體外培養(yǎng)哺乳類ESCs的方法。ESCs的基本特征是：①分化潛能多，具有分化為機體任何組織細胞、器官的能力；②無限擴增的能力, 即理論上在體外條件適宜的情況下，通過有絲分裂無限擴增，長久和穩(wěn)定地自我復制；③可以長期保持未分化狀態(tài)。除此之外，ESCs還具有集落生成能力、正常的染色體核型等特征。ESCs的這些特征，使其成為人體器官功能喪失(特別是由于毛細胞缺失造成的耳聾)后替代治療的理想選擇。目前， ESCs已被用于帕金森[1,2]、脊髓損傷[3]、糖尿病[4]動物模型的治療，另外還發(fā)現(xiàn)其可以分化為有功能的小鼠精子，與卵子結合后孵育出存活的子代小鼠[5]。

2 胚胎干細胞的分化

2.1ESCs的誘導分化 ESCs的多分化潛能使之可以在特定條件下被誘導分化為多種細胞。經(jīng)典的誘導分化方法是模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育的過程，該方法必須先在體外將ESCs誘導成擬胚體(emryoid body, EB)，經(jīng)懸浮培養(yǎng)和添加因子或基因促使其定向分化。1985年，Doetschman等通過在培養(yǎng)基中加入白血病抑制因子(LIF)，抑制ESCs分化，然后再去掉LIF，經(jīng)懸浮培養(yǎng)使ESCs變成EB。EB是大球形的懸浮團，由內(nèi)、中、外三個胚層組成。ESCs分化始于外胚層，在基因調(diào)控、蛋白表達方面與體內(nèi)早期分化有許多相似之處，但是分化的精確時間存在差異[6]。目前，ESCs已經(jīng)在體外被誘導分化為多種細胞，如造血細胞、多巴胺能神經(jīng)元、心肌細胞、生殖細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞、胰島細胞、內(nèi)皮細胞和成骨細胞等。

Rolletschek等[7]用促生長因子IL-1B、腦源性神經(jīng)生長因子(GDNF)、轉(zhuǎn)化生長因子B3(TGF-B3)等作用，使ESCs分化成了TH陽性的多巴胺能神經(jīng)元。Li等[8]將小鼠ESCs來源的EB轉(zhuǎn)移到含ES終止液的組織培養(yǎng)皿中，經(jīng)過貼壁，加入因子EGF、IGF-1、bFGF來進一步分化，最終得到表達毛細胞特異性標記物的細胞。上述研究中，雖然ESCs向不同細胞誘導時所加的因子不同，但是各種促分化因子都是在EB形成以后加入，各種促分化因子可能只能在胚體發(fā)育到一定階段才能發(fā)揮作用。Yuasa等[9]通過在EB形成前加入信號拮抗因子(Noggin)預作用3天，結果EB形成后中胚層細胞增加，由ESCs分化形成的心肌細胞數(shù)目增加了100倍。也有實驗證明，ESCs可以不經(jīng)歷EB階段，而是以單克隆方式增殖分化，這種不經(jīng)歷EB階段的培養(yǎng)方式，被認為僅僅適用在成分明確的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)特定的細胞系，可以解決細胞純化問題[10]。如果不加因子誘導，也不加LIF抑制分化過程，ESCs將會向什么方向發(fā)展呢？Hubner等[11]將小鼠ESCs培養(yǎng)在生殖細胞專用的無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)基上，沒有經(jīng)過任何處理獲得了卵子，提示ESCs向卵子的分化可能是自然發(fā)生的過程。

2.2ESCs分化的基因調(diào)節(jié) ESCs分化的本質(zhì)是基因表達發(fā)生了變化，當它向不同的組織細胞分化時會有不同基因組合的表達變化。所有ESCs都表達Oct4、Nanog和Sox2轉(zhuǎn)錄因子[12]，它們在維持ESCs自我復制和亞全能型中發(fā)揮重要作用。Oct4基因在ESCs中有豐富表達，ESCs分化一旦啟動，其表達立刻下調(diào)。Sox2基因在未分化的ESCs中表達，而隨著細胞分化而表達下調(diào)，也是內(nèi)耳毛細胞形成的上游調(diào)節(jié)基因[13,14]。Nanog基因在未分化的ESCs中大量表達，而在分化的細胞中未發(fā)現(xiàn)。有實驗證明，在維持ESCs自我更新的過程中，Nanog是與Oct4平行的另一條分子途徑[15]。從Nanog基因持續(xù)表達的ESCs培養(yǎng)體系中撤除LIF后，ESCs形態(tài)無明顯變化，Oct4基因表達水平維持正常。有關基因調(diào)控的細節(jié)問題及發(fā)揮作用的精確時間序列仍待進一步探索。

ESCs向不同組織細胞分化時也需要不同基因的參與。如Kim等[16]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子Nurr1的作用可促進ESCs分化為有功能的多巴胺神經(jīng)元，分化率達50%。Pitx3為調(diào)節(jié)中腦多巴胺能神經(jīng)元生成和維持的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，Zhao等[17]報道將Pitx3和綠熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)轉(zhuǎn)染入小鼠ESCs中，并與PA6細胞共培養(yǎng)，產(chǎn)生了更多的多巴胺能神經(jīng)元(91%)。Ying等[18]將綠色熒光蛋白敲進ESCs的Sox1區(qū)并用維甲酸促進其分化，結果ESCs分化為帶綠色的神經(jīng)祖細胞，同時表達Sox1。在利用cDNA陣點技術分析細胞分化基因的調(diào)控機制研究中，人們發(fā)現(xiàn)大約有1 000個基因參與到ESCs向神經(jīng)前體細胞的分化過程?？梢韵胂?，如果利用轉(zhuǎn)染或其他方法向干細胞中引入轉(zhuǎn)錄因子或引發(fā)干細胞定向分化的活性基因，有望實現(xiàn)ESCs的定向分化，高效率、高純度地獲得目的細胞。

3 ESCs向內(nèi)耳細胞分化的體外研究

3.1ESCs向毛細胞分化的體外研究 傳統(tǒng)觀念認為，哺乳動物內(nèi)耳發(fā)育成熟后毛細胞不可以再生。但是，近年來有關內(nèi)耳毛細胞再生的研究取得了很大進展。Li等[8]通過體外適時加入表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)、腺島素樣生長因子(insulin-like growth factor type I,IGF-1)等生長因子，從鼠ESCs逐步誘導分化為內(nèi)耳祖細胞，最終獲得表達毛細胞特異標記物的細胞——類毛細胞。徐運等[19]也用類似方法將小鼠ESCs在體外經(jīng)過15～20天的誘導分化，發(fā)現(xiàn)分化的細胞約半數(shù)表達毛細胞特異性分子標記物。上述研究提示，鼠ESCs是有可能向內(nèi)耳細胞誘導分化的。但是，這些細胞還只是結構上類似毛細胞，目前尚未證明其具有內(nèi)耳感覺毛細胞的功能。

除生長因子外，ESCs向毛細胞的分化還需要特定基因的參與。Bermingham等[20]首次發(fā)現(xiàn)Math1基因在所有內(nèi)耳感覺毛細胞中表達，其在上皮細胞向毛細胞分化和成熟中起重要作用，Math1基因缺陷小鼠胚胎不能產(chǎn)生內(nèi)耳毛細胞。Zheng等[21]報道，過表達Math1的大鼠內(nèi)耳組織經(jīng)體外培養(yǎng)后，能使耳蝸柱狀上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槊毎?，以及促進橢圓囊支持細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍巴ッ毎f明Math1能使出生后哺乳動物內(nèi)耳保留產(chǎn)生新生毛細胞的能力。Gubbles等[22]將Atoh1基因(Math1同源基因)植入孕齡11天的胎鼠聽囊，出生后的小鼠較正常小鼠多產(chǎn)生一排有功能的耳蝸毛細胞，提示Atoh1基因胚胎期的錯誤表達會使生后小鼠的耳蝸產(chǎn)生有功能的感覺細胞。Pou4f3即Brn3.1和Brn3c，在聽毛細胞和前庭毛細胞中表達，對于耳蝸毛細胞和前庭毛細胞的產(chǎn)生和維持起著重要作用[23]，該基因變異可引起聽毛細胞完全喪失及感覺神經(jīng)元繼發(fā)性損害，導致耳聾和平衡失調(diào)[24]?？梢姡琍ou4f3對毛細胞的分化和存活是必須的[25]。Gfi1(growth factor independence 1)是Pou4f3下游的靶基因，其表達限于內(nèi)耳感覺毛細胞和神經(jīng)元，但目前尚不知Gfi1是否能被Pou4f3調(diào)節(jié)[26]。Gfi1變異可致動物行為異常、出生后耳蝸毛細胞缺如及對聲音無反應[25]。Gfi1基因缺陷鼠毛細胞排列紊亂，外毛細胞無神經(jīng)支配，表達一些非正常神經(jīng)元標志物。Barh1基因在耳蝸和前庭毛細胞均有表達[27]，該基因變異導致內(nèi)、外毛細胞變性和退化[28]，提示其參與毛細胞存活的維持。另有研究表明，Barh1基因在內(nèi)耳的表達需要Math1基因的存在[29]。Math1、Pou4f3、Gfi1、Barh1基因均能促使內(nèi)耳非感覺細胞轉(zhuǎn)化成毛細胞，至于他們與毛細胞發(fā)育、功能維持之間的定量關系，目前知之甚少。內(nèi)耳毛細胞發(fā)育相關基因的發(fā)現(xiàn)從不同的層面揭示聽覺功能的分子奧秘[30]。

3.2ESCs向螺旋神經(jīng)節(jié)細胞(SGNs)分化的體外研究 SGNs為聽覺傳入神經(jīng)元，在哺乳動物，內(nèi)耳毛細胞的損失可導致SGNs形態(tài)和功能改變，從而加重感音神經(jīng)性聾。因此許多學者致力于研究能否用ESCs替代損傷的SGNs，從而恢復聽覺或提高人工耳蝸植入后聽力恢復效果。Coleman等[31]將小鼠ESCs與生后5天的大鼠耳蝸毛細胞和螺旋神經(jīng)節(jié)在體外共培養(yǎng)，結果ESCs被分化為雙極神經(jīng)元細胞。2005年，Kim等[32]將小鼠ESCs誘導分化為神經(jīng)祖細胞，并與新生小鼠前庭感覺上皮共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)這些神經(jīng)細胞向前庭毛細胞突觸部位伸出突起，并有突觸素(synaptophysin，一種38 kD的膜糖蛋白)表達，提示ESCs來源的神經(jīng)祖細胞可以恢復外周前庭系統(tǒng)的神經(jīng)連接。Matsumoto等[33]將小鼠ESCs體外誘導為神經(jīng)細胞后，與出生后3天小鼠耳蝸基底膜共培養(yǎng)，7天后發(fā)現(xiàn)胚胎干細胞來源的神經(jīng)細胞向毛細胞方向伸出突起，并表達神經(jīng)突觸標記物。最近Matsumoto等[33，34]又針對ESCs來源的神經(jīng)細胞與耳蝸內(nèi)毛細胞間形成突觸情況進行了體外實驗研究，他們將該ESCs與小鼠耳蝸感覺上皮共培養(yǎng)，7天后ESCs來源的神經(jīng)細胞突起向內(nèi)毛細胞方向生長，免疫組織化學方法分析該突觸末端與內(nèi)毛細胞相鄰的部位表達synapsin1和synaptophysin。上述研究表明，ESCs不但可在特定環(huán)境下被誘導分化為SGNs，而且后者能與內(nèi)外毛細胞形成突觸連接。但是，這種連接是否具有信號傳導功能尚需進一步探討。

Glavaski-Joksimovic等[35，36]將胚胎干細胞胚體與包含有耳蝸核的腦干切片共培養(yǎng)，結果擬懸浮的擬胚體向耳蝸核方向貼壁生長，并分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞，而且表達神經(jīng)突觸小泡標志物。說明胚胎干細胞與腦干組織共培養(yǎng)，可以分化為神經(jīng)細胞，并與腦干耳蝸核形成突觸連接。

4 ESCs向內(nèi)耳細胞分化的體內(nèi)研究

4.1ESCs向毛細胞分化的體內(nèi)研究 ESCs定向分化是內(nèi)因和外因共同作用的結果，其中外因起著重要作用。有學者認為，哺乳動物內(nèi)耳毛細胞損傷后無法再生的原因是成熟內(nèi)耳的前體細胞數(shù)量較少[37]。為此，Li等[8]先將ESCs在體外經(jīng)EGF、IGF-1、N2誘導分化為內(nèi)耳前體細胞，再將前體細胞植入雞胚聽囊上皮，結果在耳蝸毛細胞層發(fā)育為表達毛細胞標記物MyosinⅦ的類毛細胞。該研究雖然并非在哺乳動物體內(nèi)完成，但是為ESCs內(nèi)耳植入治療開辟了新的思路。Coleman等[38]將帶有EGFP的小鼠來源ESCs通過圓窗直接注入鼓階，檢測部分分化的ESCs，發(fā)現(xiàn)帶有EGFP熒光的ESCs可在鼓階中存活4周時間，其中2周時數(shù)量最多。但是，國內(nèi)外文獻中至今尚無將ESCs導入哺乳動物內(nèi)耳后分化為耳蝸感覺毛細胞的相關報道。

4.2ESCs向SGNs分化的體內(nèi)研究 Lang等[39]將ESCs體外培養(yǎng)至能表達神經(jīng)祖細胞標記物nestin后，再分別導入內(nèi)、外淋巴和蝸螺旋管，發(fā)現(xiàn)，導入外淋巴和蝸螺旋管中的ESCs最易存活，尤以造模早期階段(造模后1～3天)導入存活率最高，其中導入外淋巴中的ESCs 50%分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞，導入螺旋管者20%分化成神經(jīng)膠質(zhì)樣細胞，僅4.5%分化為神經(jīng)元細胞；相比之下，導入內(nèi)淋巴的ESCs則存活極少，這可能與導入過程本身易引起內(nèi)外淋巴液的混合和離子失衡有關。上述結果表明，ESCs內(nèi)耳植入后的存活情況取決于內(nèi)耳微環(huán)境，植入ESCs的存活、分化及潛在功能的發(fā)揮主要限于損傷早期階段。

Corrales等[40]將攜帶EGFP的ESCs來源的神經(jīng)祖細胞導入經(jīng)oubain預處理后沙鼠(SGN被選擇性損傷，而毛細胞完整)的耳蝸神經(jīng)干，觀察發(fā)現(xiàn)，導入3天后的細胞仍表達EGFP，并能被神經(jīng)元特異性標記物tubulin(微管素,微管蛋白)標記；導入后12天，可見分化的神經(jīng)元向Corti器生長；導入后64～98天，神經(jīng)元胞體發(fā)出大量神經(jīng)突起(表達β-III tubulin)，后者從蝸管發(fā)出，成簇地經(jīng)骨螺旋板到達Corti器，并與失SGN支配的毛細胞建立突觸連接。與未導入ESCs的模型動物比較，實驗組動物在靠近感覺上皮區(qū)細胞分化明顯，說明ESCs來源的神經(jīng)元有向模型動物神經(jīng)退化特定部位分化生長的特點。

縱觀文獻資料，現(xiàn)有的ESCs體內(nèi)導入的作用靶點主要是變性的神經(jīng)元，僅少數(shù)針對受損的耳蝸毛細胞[8]；導入方法與基因及其他細胞導入[41～43]基本一致，具體方法包括：經(jīng)鼓階打孔注射[44]、經(jīng)圓窗膜注射[39]、中階導入法[45]、經(jīng)蝸軸注入耳蝸神經(jīng)干[46]等；導入后細胞的存活時間大致在1～9周不等[44，46～48]。至于ESCs分化到什么階段導入活體耳蝸最為合適，目前尚無一致意見，如：Coleman等[38]將ESCs經(jīng)體外誘導分化至神經(jīng)前體階段，導入耳蝸鼓階；Corrales等[40]將ESCs通過 F12等因子作用，分化成祖細胞階段再導入耳蝸神經(jīng)干；而Lang等[39]將ESCs體外培養(yǎng)至表達nestin階段，分別通過圓窗膜導入鼓階外淋巴、經(jīng)耳蝸骨板導入蝸螺旋管(Rosenthal’s canal,RC)和經(jīng)圓窗膜入鼓階后再經(jīng)基底膜導入中階內(nèi)淋巴中。但無論采取何種導入方法，都應盡力避免引起內(nèi)、外淋巴液的混合，否則，可能會導致聽力下降甚至全聾，導入的細胞也無法存活[39，40]。

5 結語

體內(nèi)、外實驗研究結果初步表明，ESCs內(nèi)耳導入后具有被誘導分化為感覺毛細胞和神經(jīng)元的潛能，但該方法最終是否可以用于感音神經(jīng)性聾的臨床治療尚難以定論，許多問題有待進一步研究闡明，如： ESCs體外誘導至何種程度開始導入內(nèi)耳最為合適？ESCs導入耳蝸后能否定位在Corti器的適當位置？ESCs導入后能否進一步分化為所需要的內(nèi)耳細胞？能否有傳入和傳出神經(jīng)的支配并恢復感知聲信號的功能？如何解決ESCs來源問題引起的排斥反應、安全性問題以及所涉及的倫理問題？對這些問題的解答有賴于更多科學資料的積累。

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