速尿?qū)π∈舐菪窠?jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞鉀、鈉通道電流的影響

鄧嘉虹 楊黎 姜鶴群 蔡春春

速尿是袢利尿劑的代表藥物，是臨床廣泛應(yīng)用于腎功能和心功能衰竭性水腫、早產(chǎn)兒和支氣管、肺發(fā)育不良新生兒肺水腫的有效利尿劑。但速尿具有耳毒性，接受較大劑量速尿治療的患者，可出現(xiàn)暫時(shí)性的聽閾提高并伴有耳鳴和眩暈，長期使用還可出現(xiàn)永久性的聽閾提高。目前研究認(rèn)為速尿主要引起血管紋的水腫和囊性變、耳蝸內(nèi)動(dòng)作電位的幅度下降、抑制K+-Na+-ATP酶、引起Corti器外毛細(xì)胞的水腫等[1，2]。耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiral ganglion neuron, SGN)分為兩型，Ⅰ型細(xì)胞為雙極神經(jīng)元，與內(nèi)毛細(xì)胞形成突觸，其中樞突組成聽神經(jīng)；Ⅱ型細(xì)胞為假單極神經(jīng)元，與外毛細(xì)胞形成突觸。本研究利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察速尿?qū)β菪窠?jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞鉀、鈉離子通道電流的影響，以便進(jìn)一步了解速尿的耳毒性機(jī)制，為其耳毒性的預(yù)防和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用出生1～6 d發(fā)育正常的昆明種乳小鼠15只30耳，雌雄不分。

1.2螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的體外分離 將小鼠耳蝸分離以后，在pH7.4的Hank’s平衡鹽溶液中分離并去除骨性耳蝸部分，然后將膜性耳蝸沿螺旋緣處把外側(cè)血管紋、Corti器去除，僅剩余內(nèi)側(cè)螺旋神經(jīng)節(jié)組織，將神經(jīng)組織輕柔地分離并切割，用D-Hank’s平衡鹽溶液洗滌組織塊。然后，用2%的胰蛋白酶對螺旋神經(jīng)元組織進(jìn)行酶解，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁滿意后，用細(xì)胞外液小心置換含血清的培養(yǎng)液，直至細(xì)胞外液清澈，獲得符合試驗(yàn)條件的SGN細(xì)胞(胞膜光滑、胞質(zhì)透光性好、核完整、有兩條突觸)。

1.3溶液成分 電極內(nèi)液：(mmol/L)KCl 112，MgCl22，CaCl20.1，EGTA 11，Hepes 10，用KOH調(diào)節(jié)pH值為7.4，調(diào)節(jié)滲透壓為310 mmol/L，若記錄鈉電流則將KCl 112改為CsCl 112。 細(xì)胞外液：(mmol/L)NaCl 137，KCl 5，CaCl21.7， MgCl21，葡萄糖17，蔗糖 50，Hepes 10，用NaOH 調(diào)節(jié)pH值為7.5，調(diào)節(jié)滲透壓為300 mmol/l。終止酶解用細(xì)胞培養(yǎng)液：90%杜伯科改良的伊格爾培養(yǎng)基，10%胎牛血清，pH值為7.3～7.4。延遲整流鉀通道阻滯劑氯化四乙胺(TEA)的濃度為25 mmol/L，4-氨基吡啶(4-AP) 的濃度為0.15 mmol/L。鈉通道阻滯劑河豚毒素(TTX)的濃度為0.05 μmol/L。速尿的細(xì)胞外給藥濃度為2 500 μg/ml，灌注時(shí)間為10分鐘左右。

1.4SGN細(xì)胞鉀、鈉離子通道電流的記錄

1.4.1全細(xì)胞電壓鉗模式的形成和細(xì)胞外給藥 采用P-97三步水平拉制儀(Sutter Instrument Co. USA)拉制硅硼玻璃微電極(厚壁、硬質(zhì)，北京電子所)，并在電極尖端涂布硅酮樹脂和進(jìn)行熱拋光(MF-900電極熱拋光儀)，使玻璃微電極尖端直徑小于1 μm，充灌電極內(nèi)液后的阻抗為3～7 mΩ。在MP-285膜片鉗微操縱儀(Sutter Instrument Co. USA)的推動(dòng)下，讓玻璃微電極尖端接觸SGN細(xì)胞膜，并應(yīng)用負(fù)壓抽吸使電極尖端和細(xì)胞膜形成高阻封接，封接電阻在1.0 GΩ以上，對膜片造成電化學(xué)隔離。高阻封接穩(wěn)定后，通過負(fù)壓抽吸使吸附于電極尖端的一小片細(xì)胞膜破裂，從而形成全細(xì)胞的膜片鉗記錄模式。本實(shí)驗(yàn)采用Axopatch 200B膜片鉗放大器(Axon Instruments，USA)，并使用“Y管”胞外給藥裝置(Sutter Instrument Co. USA)進(jìn)行局部細(xì)胞外微灌流給藥。該給藥系統(tǒng)能在20 ms內(nèi)使目標(biāo)細(xì)胞周邊的外液完全被交換。

1.4.2延遲整流鉀通道電流和鈉通道電流記錄參數(shù)的設(shè)定 延遲整流鉀通道電流記錄參數(shù)的設(shè)定：鉗制電壓(VH)為-80 mV，命令電壓由-100 mV至+40 mV，步長10 mV，時(shí)程為100 ms。

鈉通道電流記錄參數(shù)的設(shè)定：鉗制電壓(VH)為-80mv，命令電壓由-80 mV至+60 mV，步長10 mV，時(shí)程為100 ms。

2 結(jié)果

2.1SGN的分離 通過機(jī)械分離和酶解，成功獲得小鼠耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞，在倒置相差顯微鏡下觀察到Ⅰ型螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈橢圓形，邊緣光滑，胞質(zhì)透明，呈亮白色，細(xì)胞折光性好，細(xì)胞多數(shù)有兩個(gè)突起；個(gè)別細(xì)胞只有一個(gè)突起或者胞體變?yōu)轭悎A形，胞質(zhì)不透明，胞膜欠光滑，細(xì)胞折光性差，這類細(xì)胞可能與酶解過度有關(guān)，故未納入實(shí)驗(yàn)研究中。

2.2SGN細(xì)胞鉀、鈉離子通道電流的記錄

2.2.1SGN細(xì)胞延遲整流鉀電流的記錄 應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)可以記錄到鉀鈉混合電流圖(圖1)。應(yīng)用加入0.05 μmol/L TTX的細(xì)胞外液，可以記錄到緩慢上升、持續(xù)無衰減的外向電流，加入25 mmol/L的TEA和0.15 mmol/L的4-AP后，外向電流絕大多數(shù)被抑制，證明其為延遲整流鉀電流，活化時(shí)間常數(shù)(τ)為3.30±0.59 ms(圖2)。

圖1 電壓依賴性鉀鈉混合電流

2.2.2SGN細(xì)胞鈉電流的記錄 在加入25 mmol/L的TEA和0.15 mmol/L的4-AP的細(xì)胞外液中，應(yīng)用含有CsCl的電極內(nèi)液，可以基本抑制外向鉀電流，試驗(yàn)記錄到快速激活的內(nèi)向離子電流。當(dāng)在細(xì)胞外液中加入0.05 mmol/L的TTX后，內(nèi)向電流被阻斷，證明內(nèi)向電流是鈉通道電流。鈉通道的活化發(fā)生于膜電位位于-30～ -40 mV時(shí)，至-20 mV時(shí)鈉電流達(dá)到峰值，到膜電位位于+20 mV左右時(shí)產(chǎn)生內(nèi)向電流的離子通道失活(圖3)。

圖2 鉀通道抑制劑對鉀通道的作用

上圖是在細(xì)胞外液中加入TTX抑制內(nèi)向鈉電流后的延遲整流鉀電流圖，下圖是在細(xì)胞外液中加入鉀通道抑制劑TEA和4-AP后外向鉀電流被明顯抑制

圖3 鈉通道抑制劑對鈉通道的作用

上圖是在細(xì)胞外液中加入TEA和4-AP、在細(xì)胞內(nèi)液中加入CsCl后外向延遲整流鉀電流基本被抑制，可觀察到內(nèi)向鈉電流；下圖是在細(xì)胞外液中加入TTX后內(nèi)向鈉電流被完全阻滯

2.3速尿?qū)GN細(xì)胞鉀、鈉離子通道電流的作用

2.3.1速尿?qū)GN細(xì)胞鉀離子通道電流的作用 當(dāng)在細(xì)胞外液中加入0.05 μmol/L的TTX后，內(nèi)向的鈉電流被完全阻滯，僅剩余外向的延遲整流鉀通道電流，通過Y管逐漸在細(xì)胞外液中加入2 500 μg/ml的速尿，隨著細(xì)胞外液中速尿濃度的增加，鉀電流幅度逐漸變小，最后一直維持在+200～+300 pA之間不再變化。然后用加入0.05 μmol/L TTX的細(xì)胞外液逐漸洗滌含速尿的細(xì)胞外液時(shí)，外向鉀電流逐漸開始恢復(fù)。試驗(yàn)觀察到在速尿?qū)ρ舆t整流鉀通道的作用穩(wěn)定后1、5、10 min時(shí)，用含TTX的細(xì)胞外液洗滌速尿，鉀電流的峰電流幅值可以分別恢復(fù)到速尿作用以前的98%、64%、25%?？梢姡倌?qū)︹浲ǖ雷饔脮r(shí)間的長短與其對SGN細(xì)胞鉀通道活性的損害程度呈正相關(guān)(圖4)。

2.3.2速尿?qū)GN細(xì)胞鈉離子通道電流的作用 當(dāng)在細(xì)胞外液中加入25 mmol/L的TEA和0.15 mmol/L的4-AP，應(yīng)用含有CsCl的電極內(nèi)液后，外向的延遲整流鉀電流基本被完全阻滯。通過Y管逐漸在細(xì)胞外液中加入速尿，內(nèi)向鈉電流隨著細(xì)胞外液中速尿濃度的增加，和鉀電流一樣電流幅度逐漸變小，但最后鈉電流的峰電流幅值基本穩(wěn)定在速尿作用前峰電流幅值的30%左右，不再變化。在速尿作用穩(wěn)定后的1、5、10 min時(shí)，用含TEA和4-AP的細(xì)胞外液逐漸洗滌細(xì)胞外液中的速尿，鈉電流的幅值可以分別恢復(fù)到作用前的96%、76%和54%左右(圖5)。

圖4 速尿?qū)ρ舆t整流鉀通道的作用

上圖是在細(xì)胞外液中加入TTX抑制內(nèi)向鈉電流后的延遲整流鉀電流圖；中圖是在細(xì)胞外液中加入2500μg/ml的速尿以后外向鉀電流被明顯抑制，僅在+200～+300pA左右；下圖由上到下的三條曲線分別表示在速尿?qū)ρ舆t整流鉀通道的作用穩(wěn)定后1、5、10 min洗滌細(xì)胞外液中的速尿時(shí)，鉀電流可以恢復(fù)到作用以前的98%、64%、25%。說明速尿作用時(shí)間越短，對SGN細(xì)胞延遲整流鉀通道的損害程度越小

圖5 速尿?qū)︹c通道的作用

A是在細(xì)胞外液中加入TEA和4-AP， 細(xì)胞內(nèi)液中加入CsCl，基本抑制外向鉀電流后的內(nèi)向鈉電流。B代表在細(xì)胞外液中加入2 500 μg/ml的速尿以后，內(nèi)向鈉電流被抑制到原來峰電流的30%左右。C、D、E分別代表速尿作用穩(wěn)定后1、5、10 min時(shí)，用細(xì)胞外液洗脫速尿，內(nèi)向鈉電流可分別恢復(fù)到加藥前峰電流幅值的96%、76%和54%

3 討論

速尿主要損害耳蝸的血管紋，引起耳蝸淋巴液中電解質(zhì)濃度的改變，從而導(dǎo)致聽覺障礙。速尿可引起耳蝸內(nèi)淋巴中Na+濃度增加，而K+濃度明顯降低，有學(xué)者[3]認(rèn)為外淋巴中Na+濃度增加是由于速尿的利尿作用引起的體液脫水所致，外淋巴中K+濃度升高起因于內(nèi)耳中袢利尿劑對電解質(zhì)的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)作用或由內(nèi)淋巴中高濃度K+引起的繼發(fā)性改變。由于袢利尿劑阻滯K+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，減少K+進(jìn)入內(nèi)淋巴，致使內(nèi)淋巴中K+濃度降低，也可能是對血管紋的物理或化學(xué)效應(yīng)降低邊緣細(xì)胞緊密連接的嚴(yán)密程度，使Na+和H2O從外淋巴和血漿自細(xì)胞間隙進(jìn)入內(nèi)淋巴，此學(xué)說可以解釋袢利尿劑為何引起內(nèi)淋巴中Na+升高和K+降低[4]。本研究表明，速尿可以作用于SGN細(xì)胞的外向延遲整流鉀通道和內(nèi)向鈉通道，引起通道電流幅度減小，導(dǎo)致SGN細(xì)胞內(nèi)的Na+降低、K+升高，細(xì)胞外的Na+升高、K+降低，與內(nèi)淋巴中的離子濃度變化相同。

孔維佳[5]用豚鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射速尿引起的血管紋水腫和蝸內(nèi)電位幅度的變化(即結(jié)構(gòu)和功能)之間呈很好的相關(guān)性。而張運(yùn)東[2]的研究表明，即使離體培養(yǎng)的血管紋組織周圍的速尿濃度達(dá)到2 500 μg/ml(相當(dāng)于動(dòng)物體內(nèi)應(yīng)用劑量625 mg/kg以上)，速尿?qū)ρ芗y組織也無明顯的誘導(dǎo)水腫的毒性作用。近年來有學(xué)者研究表明，速尿是通過直接抑制血管紋緣細(xì)胞的Na+- K+-2Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體，減少K+、Cl-向內(nèi)淋巴的分泌，從而影響耳功能。本實(shí)驗(yàn)在SGN細(xì)胞外同樣應(yīng)用2 500 μg/ml的速尿，觀察到外向的延遲整流鉀通道電流被明顯抑制，說明速尿可以抑制K+從細(xì)胞內(nèi)向細(xì)胞外的流動(dòng)，使細(xì)胞內(nèi)的K+增加，這可能影響SGN細(xì)胞超極化后電位的產(chǎn)生，影響動(dòng)作電位的不應(yīng)期及復(fù)極化過程，速尿通過影響細(xì)胞膜的電生理特性而產(chǎn)生耳毒性。

SGN細(xì)胞是聽覺傳導(dǎo)的一級(jí)神經(jīng)元，對于聽覺信息的神經(jīng)編碼起著至關(guān)重要的作用，Hurley[6]的研究表明速尿可引起SGN細(xì)胞脫髓鞘，影響動(dòng)作電位的產(chǎn)生。本研究利用全細(xì)胞膜片鉗的研究方法證實(shí)在細(xì)胞外液中加入速尿以后，SGN細(xì)胞外向延遲整流鉀電流和內(nèi)向鈉電流峰電流幅值均減小，其中延遲整流鉀電流可被阻滯到僅+200～+300 pA左右，鈉電流可被阻滯到速尿作用前峰電流幅值的30%左右，相對延遲整流鉀通道，速尿?qū)︹c通道的阻滯作用更大。同時(shí)，還觀察到在速尿作用穩(wěn)定后的1、5、10 min時(shí)開始洗脫速尿，延遲整流鉀電流和鈉電流分別可以恢復(fù)到速尿作用前峰電流幅值的98%、64%、25%和96%、76%和54%。說明如果在速尿?qū)GN細(xì)胞離子通道作用的初期，盡快地洗脫SGN細(xì)胞周圍的速尿成分，可以使SGN細(xì)胞的鉀、鈉離子通道的功能得到更大程度的恢復(fù)，減少速尿的耳毒性。提示臨床上使用速尿治療相關(guān)疾病時(shí)，可以短期或間斷用藥，保證內(nèi)耳速尿的盡快代謝，減少其蓄積作用，從而預(yù)防速尿的耳毒性發(fā)生。

4 參考文獻(xiàn)

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