光動(dòng)力療法在骨肉瘤治療中的初步實(shí)驗(yàn)探討

龔海洋， 胡 碩， 姚建忠， 蔡鄭東

骨肉瘤是高度惡性的間葉組織腫瘤，是兒童和青少年最常見的原發(fā)骨惡性腫瘤，大約80%～90%發(fā)生于四肢長管狀骨干骺端。近25年來，盡管國際諸多研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行了大量的努力，但骨肉瘤生存率依然停滯不前。目前主要治療方法仍為手術(shù)和放化療[1]。雖然近年來出現(xiàn)了各種手術(shù)方式的改良及放化療方案的改進(jìn)，但收效甚微。臨床中經(jīng)常遇到的情況是患者在就診時(shí)腫瘤的體積已經(jīng)很大，完整切除相當(dāng)困難，廣泛切除更是很難實(shí)現(xiàn)。鄰近關(guān)節(jié)、重要神經(jīng)血管的腫瘤在實(shí)行保肢手術(shù)的同時(shí)，瘤床周圍可能殘留有鏡下病灶。發(fā)生于脊椎、脊柱旁、骶尾部、腹膜后區(qū)的骨與軟組織惡性腫瘤往往與周圍重要組織臟器粘連，完整切除難以實(shí)現(xiàn)。放療常常損傷臨近的血管、神經(jīng)及重要臟器，療效亦不甚理想[2]。多藥耐藥則是骨肉瘤化療失敗的主要原因[3]。

18世紀(jì)末，Niels Finsen成功地利用日光和人工光照射治療皮膚結(jié)核病，率先開啟了光動(dòng)力療法的研究。光動(dòng)力療法的基本原理是利用腫瘤細(xì)胞及正常組織細(xì)胞對光敏劑有不同親和性的特點(diǎn)，腫瘤組織攝取和存留的光敏劑較多[4]，當(dāng)光敏劑選擇性地聚集于病變部位的腫瘤細(xì)胞后，使用適當(dāng)波長(通常500～800 nm)的可見光對病變的部位進(jìn)行照射。光敏劑吸收光子的能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在氧分子存在的情況下，受激發(fā)的光敏劑將能量傳遞給氧，產(chǎn)生一些氧化活性分子(radical oxygen species, ROS)。ROS通過氧化作用來攻擊細(xì)胞結(jié)構(gòu)，這種損傷可能造成細(xì)胞膜或蛋白的氧化損傷。當(dāng)氧化損傷的積累超過一定閾值時(shí)，腫瘤細(xì)胞便開始死亡[5]，進(jìn)而達(dá)到治療目的。進(jìn)入新世紀(jì)以來，國際上關(guān)于光動(dòng)力治療的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用不斷深入和擴(kuò)展[6]。目前國內(nèi)對于光動(dòng)力療法(photodynamic therapy，PDT)治療骨肉瘤的研究還不是很多。本課題小組率先于2009年在國內(nèi)開展光敏劑苯并葉綠卟啉(BCPD-17)對骨肉瘤細(xì)胞(LM-8)殺傷效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，報(bào)道如下。

1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

觀察不同照射能量，不同光敏劑濃度下腫瘤細(xì)胞抑制率的變化，并在電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.1 材料與方法

1.1.1 細(xì)胞株與主要試劑 小鼠骨肉瘤細(xì)胞株LM-8，由Tatsuya Asai等建立并贈(zèng)送；光敏劑BCPD-17 (Benzochloroporphyrin derivative-17) 脂質(zhì)體劑型(5 mg/mL)，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姚建忠教授提供；溴化四氮唑藍(lán)(MTT)；二甲基亞砜(DMSO)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 分為空白對照組(不加光敏劑，不接受激光照射)、暗毒性組(只加光敏劑，不接受激光照射)、激光組(不加光敏劑，只接受激光照射)、PDT組(加光敏劑及激光照射，同時(shí)設(shè)置不同的光敏劑濃度和激光的劑量)4組。

1.1.3 MTT法測定抑制率 活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長為540 nm處測定其光吸收值，可間接反應(yīng)活細(xì)胞的數(shù)量并推算死細(xì)胞的數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。按以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率(%)= (對照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/對照孔OD值×100%。

1.1.4 電鏡觀察 激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察對數(shù)生長期細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變及細(xì)胞器改變。

1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包對結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.1 LM-8細(xì)胞PDT 24 h后的OD540值及細(xì)胞抑制率(見表1、2)

表1 不同BCPD-17濃度、不同激光劑量PDT 24 h后的小鼠骨肉瘤LM-8細(xì)胞OD540值

表2 不同BCPD-17濃度、不同激光劑量PDT 24 h后小鼠骨肉瘤LM-8細(xì)胞體外抑制率(%)

結(jié)果顯示：PDT 24 h后，光敏劑BCPD-17對LM-8細(xì)胞有明顯的殺傷作用。從表1中可見隨光敏劑濃度及激光光照劑量的提高，小鼠骨肉瘤LM-8細(xì)胞的OD540值顯著下降。當(dāng)BCPD-17>4 μg/mL時(shí)，不同劑量激光照射后的OD540值顯著下降，結(jié)果與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表2中可見單純的光照和單純加光敏劑對LM-8細(xì)胞均無明顯的殺傷作用。當(dāng)BCPD-17>4 μg/mL和光照能量>3 J/cm2時(shí)，抑制率>50%。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 暗毒性組、激光照射組及空白對照組LM-8細(xì)胞的形態(tài)均正常，呈多角形生長，結(jié)構(gòu)完整，生長狀態(tài)良好(圖1)。HE染色見空白對照組的細(xì)胞形態(tài)正常，呈多角形生長，細(xì)胞核大而深染，可見核分裂相，細(xì)胞質(zhì)呈均質(zhì)紅染(圖2)；2 μg/mL PDT組可見個(gè)別的壞死細(xì)胞；4 μg/mL組可見細(xì)胞壞死比例顯著增多，細(xì)胞腫脹，胞膜破裂，胞質(zhì)外流，細(xì)胞溶解壞死(圖3)；8 μg/mL組可見細(xì)胞大部分壞死，細(xì)胞質(zhì)已彌散，多見細(xì)胞核固縮、崩裂、核膜裂解。

圖1 正常小鼠骨肉瘤LM-8細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整

圖2 正常LM-8細(xì)胞HE染色，細(xì)胞核大深染，可見核分裂相，胞漿均質(zhì)紅染(×200)

圖3 濃度4 μg/mL BCPD-17-PDT組，細(xì)胞壞死比例增多，胞膜破裂，胞質(zhì)外流，細(xì)胞溶解壞死(×200)

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

建立小鼠移植骨肉瘤皮下模型，手術(shù)邊緣切除腫瘤后，聯(lián)合應(yīng)用BCPD-17介導(dǎo)的光動(dòng)力輔助治療，觀察是否降低腫瘤的局部復(fù)發(fā)率。

2.1 材料與方法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞及光敏劑來源同上；C3H 4周齡雌性小鼠30只，體重18～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(京)2006-2009；PDT630激光腫瘤治療儀，為半導(dǎo)體激光機(jī)，輸出功率0-1W可調(diào)，光纖最大輸出功率>1W，波長630 nm，由桂林市興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司提供；LX-Ⅲ功率計(jì)，中國計(jì)量研究院生產(chǎn)，矯正系數(shù)為0.99，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院提供。

2.1.2 LM-8骨肉瘤模型的建立 荷瘤模型成功后，待皮下瘤塊直徑約10～12 mm時(shí)，選取半球形、生長良好、表皮無破潰的小鼠進(jìn)行光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)分組與治療方法 荷瘤小鼠腫瘤直徑達(dá)10～12 mm時(shí)，隨機(jī)分為3組：(1)對照組：僅邊緣切除腫瘤而無光動(dòng)力治療；(2)手術(shù)聯(lián)合低能量密度PDT組：靜脈注射BCPD-17(5 mg/kg)，6 h后行腫瘤邊緣切除聯(lián)合激光照射(激光波長630 nm，功率密度200 mW/cm2，能量密度240 J/cm2，照射時(shí)間20 min，光斑1.5 cm)；(3)手術(shù)聯(lián)合高能量密度PDT組：除激光能量密度為360 J/cm2外，其余操作同(2)。

2.1.4 觀測指標(biāo) 小鼠腫瘤邊緣切除后觀察4周，觀測對照組與手術(shù)聯(lián)合光動(dòng)力治療組的腫瘤復(fù)發(fā)情況。

2.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以例數(shù)表示，檢驗(yàn)比較各組復(fù)發(fā)率的情況，統(tǒng)計(jì)軟件為SPSS 12.0，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

手術(shù)聯(lián)合光動(dòng)力療法后，大大抑制腫瘤邊緣切除后的局部復(fù)發(fā)，減少了復(fù)發(fā)率，其中高能量密度組與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。光動(dòng)力治療4周后，對照組10只小鼠中，僅1只小鼠沒有復(fù)發(fā)，其余9只小鼠在病灶切緣出現(xiàn)隆起腫塊，表明局部復(fù)發(fā)(圖4)。治療組中，早期各組小鼠的手術(shù)區(qū)中心下陷，光照區(qū)形成焦痂，可見切緣皮下組織也有壞死，在聯(lián)合治療的高劑量激光組(360 J/cm2)更加明顯。但后期愈合良好，邊緣切除術(shù)聯(lián)合光動(dòng)力治療無傷口延遲愈合或皮膚缺損等副作用。聯(lián)合治療4周后，手術(shù)聯(lián)合PDT治療的低劑量激光組(240 J/cm2)10只小鼠中4只小鼠出現(xiàn)腫瘤局部復(fù)發(fā)，而在高劑量激光組(360 J/cm2)小鼠中只有2只局部復(fù)發(fā)，其余未見復(fù)發(fā)(圖5)。

表3 手術(shù)聯(lián)合光動(dòng)力治療4周后，各組的腫瘤復(fù)發(fā)情況

注：#P<0.05(與對照組相比)

圖4 對照組病灶切緣出現(xiàn)隆起腫塊，表明局部復(fù)發(fā)

圖5 治療組小鼠病灶切緣未見復(fù)發(fā)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)初步了解了小鼠骨肉瘤細(xì)胞LM-8對光動(dòng)力療法的反應(yīng)方式，BCPD-17光動(dòng)力療法可以抑制小鼠骨肉瘤細(xì)胞LM-8的生長，抑制率與光敏劑濃度及激光劑量成正相關(guān)。同時(shí)光敏劑藥物本身不具備暗毒性，單純的光照對細(xì)胞也沒有明顯的抑制作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，手術(shù)邊緣切除腫瘤后，聯(lián)合應(yīng)用BCPD-17介導(dǎo)的光動(dòng)力輔助治療，能夠降低腫瘤的局部復(fù)發(fā)率，高劑量激光組(360 J/cm2)與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

我們應(yīng)用光敏劑BCPD-17進(jìn)行骨肉瘤的光動(dòng)力研究，在對小鼠骨肉瘤細(xì)胞LM-8體外光動(dòng)力實(shí)驗(yàn)顯示，BCPD-17有明顯的細(xì)胞毒作用。光動(dòng)力的細(xì)胞毒作用依賴BCPD-17濃度和激光照射劑量。激光照射劑量相同時(shí)，BCPD-17濃度越高，細(xì)胞內(nèi)積聚的光敏劑就越多，在受到激光照射時(shí)，其光敏化效率就越高，抗腫瘤作用越強(qiáng)。同理，相同BCPD-17濃度下，隨著激光照射的劑量越高，光敏化產(chǎn)生的單線態(tài)氧等光毒性產(chǎn)物亦隨之增加，所產(chǎn)生的光動(dòng)力學(xué)殺傷效應(yīng)也越強(qiáng)。單獨(dú)用激光照射以及單獨(dú)用BCPD-17無激光照射時(shí)均未看到抗腫瘤作用，這也反映出光動(dòng)力治療的靶向性特點(diǎn)。

光動(dòng)力作用引起的細(xì)胞死亡，有凋亡與壞死兩種方式，光敏劑的性質(zhì)對于細(xì)胞的死亡機(jī)制有重要影響。有研究表明PDT對膜結(jié)構(gòu)最具破壞性，特別是線粒體膜和溶酶體[7-8]。線粒體光損傷后，細(xì)胞色素C釋放，由此開始的凋亡級聯(lián)反應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[9]。光動(dòng)力療法誘使細(xì)胞結(jié)構(gòu)解體及遺傳信息改變，進(jìn)而可直接誘發(fā)腫瘤細(xì)胞死亡[10-11]。本實(shí)驗(yàn)觀察到在BCPD-17濃度為4 μg/mL光照能量為3 J/cm2時(shí)對LM-8細(xì)胞開始有顯著的殺傷效果，形態(tài)學(xué)觀察可見大多數(shù)細(xì)胞脹大，細(xì)胞器破壞辨認(rèn)不清，胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放，進(jìn)而細(xì)胞死亡，但對其機(jī)制仍需做進(jìn)一步的深入研究。

光動(dòng)力療法(PDT)是一種應(yīng)用于局部腫瘤病變的治療方法，它的優(yōu)勢是可以保護(hù)周圍正常組織的解剖和功能，使晚期腫瘤的微創(chuàng)手術(shù)切除和輔助治療[12-13]成為可能。使用PDT的主要目的是避免手術(shù)、減少手術(shù)的范圍或者是避免高劑量放射治療產(chǎn)生的并發(fā)癥，因此，PDT已經(jīng)可以應(yīng)用于不同分期的腫瘤患者的治療，既可以用作緩解癥狀，輔助手術(shù)治療，也可以作為一個(gè)原發(fā)腫瘤的治療方法并可預(yù)防上皮不典型增生發(fā)展成癌癥。

PDT目前尚有許多課題有待研究和探索，如(1)PDT與手術(shù)、放療、化療等如何更合理地結(jié)合，探索PDT使用的最佳時(shí)機(jī)，以最大限度地滅活殘余病灶，提高惡性腫瘤的治愈率；(2)研制更加有效的光敏劑，解決PDT殺傷深度問題，從而治療大體積腫瘤；(3)對激光光源的深入研究，解決光敏劑和與之匹配并有足夠輸出功率的穩(wěn)定單色光源問題，做到最大限度地作用于腫瘤組織，而對正常組織損傷減至最低，真正體現(xiàn)PDT選擇性治療的特性等等。PDT治療在我國開展的時(shí)間不長，臨床經(jīng)驗(yàn)較少，隨訪時(shí)間不足，尤其是在骨腫瘤治療方面才剛剛起步，對于體積較大的骨與軟組織惡性腫瘤，治療的報(bào)道更少，有待進(jìn)一步的臨床和實(shí)驗(yàn)研究。

[1] Marec-Bérard P, Chotel F, Claude L. PNET/Ewing tumours: current treatments and future perspectives[J]. Bull Cancer, 2010, 97(6):707-713.

[2] Sheplan LJ, Juliano JJ. Use of radiation therapy for patients with soft-tissue and bone sarcomas[J]. Cleve Clin J Med, 2010, 77(Suppl 1):S27-29.

[3] Oudard S, Marie JP, Pujade Lauraine E. MDR (Multiple Drug Resistant) type of resistance to chemotherapy in clinical practice[J]. Bull Cancer, 1996, 83(8):609-618.

[4] Mang TS, Dougherty TJ, Potter WR, et al. Photobleaching of porphyrins used in photodynamic therapy and implications for therapy[J]. Photochem Photobiol, 1987, 45(4):501-506.

[5] Henderson BW, Dougherty TJ. How does photodynamic therapy work?[J]. Photochem Photobiol, 1992, 55(1):145-157.

[6] Brown SB, Brown EA, Walker I. The present and future role of photodynamic therapy in cancer treatment[J]. Lancet Oncol, 2004, 5(9): 497-508.

[7] Lavi A, Weitman H, Holmes RT, et al. The depth of porphyrin in a membrane and the membrane’s physical properties affect the photosensitizing efficiency[J]. Biophys J, 2002, 82(4):2101-2110.

[8] Mak NK, Li KM, Leung WN, et al. Involvement of both endoplasmic reticulum and mitochondria in photokilling of nasopharyngeal carcinoma cells by the photosensitizer Zn-BC-AM[J]. Biochem Pharmacol, 2004, 68(12): 2387-2396.

[9] Granville DJ, Cassidy BA, Ruehlmann DO, et al. Mitochondrial release of apoptosis-inducing factor and cytochrome c during smooth muscle cell apoptosis[J]. Am J Pathol, 2001,159(1):305-311.

[10] Pogue BW, Ortel B, Chen N, et al. A photobiological and photophysical-based study of phototoxicity of two chlorines[J]. Cancer Res, 2001, 61(2):717-724.

[11] Rancan F, Wiehe A, N?bel M, et al. Influence of substitutions on asymmetric dihydroxychlorins with regard to intracellular uptake, subcellular localization and photosensitization of Jurkat cells[J]. J Photochem Photobiol B, 2005, 78(1): 17-28.

[12] Lou PJ, Jager HR, Jones L, et al. Interstitial photodynamic therapy as salvage treatment for recurrent head and neck cancer[J]. Br J Cancer, 2004, 91(3):441-446.

[13] Yamamoto J, Hirano T, Li S, et al. Selective accumulation and strong photodynamic effects of a new photosensitizer, ATX-S10.Na(II), in experimental malignant glioma[J]. Int J Oncol, 2005, 27(5):1207-1213.