一株磷礦粉分解細菌的篩選與鑒定

方亭亭，鄧桂芳，劉華中，周毅峰

(湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

磷是生物重要的營養(yǎng)元素之一，土壤磷素的循環(huán)與碳、氮、硫等元素的循環(huán)不一樣，是一種典型的沉積循環(huán)，主要在土壤、植物和微生物之間進行[1].土壤中能被植物吸收利用的有效態(tài)無機磷很低，一般只占全磷量的2%～3%[2].許多土壤微生物能夠?qū)⒅参镫y以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形態(tài)，具有這種能力的微生物稱為解磷菌或溶磷菌(phosphate-solubilizingmicroorganisms)[3].植物施入不溶性的磷肥，經(jīng)接種土壤微生物后，促進了植株的生長，增加磷的吸收[4].目前報道解磷細菌類有芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞桿菌(Pseudomonas)、歐文氏菌(Erwinia)、土壤桿菌(Agrobacterium)、沙雷氏菌(Serratia)、黃桿菌(Flavobacterium)、腸細菌(Enterbacter)、微球菌(Micrococcus)、固氮菌(Azotobacter)、根瘤菌(Bradyrhizobium)、沙門氏菌(Salmonella)、色桿菌(Clromobacterium)、產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、節(jié)細菌(Arthrobacter)、硫桿菌(Thiobacillus)、埃希氏菌(Escherichia)；解磷真菌類有青霉菌(Penicillium)、曲霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、鐮刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)；放線菌有鏈霉菌(Streptomyces)；AM菌根菌[3～5].本研究是從土壤中篩選高效解磷菌，為將其開發(fā)解磷微生物菌劑提供基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 磷礦粉及土樣來源

磷礦采自湖北省恩施市白楊坪九根樹村,所獲磷礦經(jīng)研磨成粉. 土樣采于湖北省恩施市白楊坪九根樹村磷礦表層土壤.

1.2 培養(yǎng)基

磷酸鈣固體培養(yǎng)基[6]各成分質(zhì)量分數(shù)(%)：葡萄糖 1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，Ca3(PO4)20.5，瓊脂2.0，pH7.0～7.5.

磷礦粉固體培養(yǎng)基[6]各成分質(zhì)量分數(shù)(%)：葡萄糖 1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，磷礦粉0.5，瓊脂2.0，pH 7.0～7.5.

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[7]各成分質(zhì)量分數(shù)(%)：牛肉膏0.4，蛋白胨1.0，NaCl 0.5，瓊脂2.0，pH 7.2～7.5.

發(fā)酵培養(yǎng)基[6]各成分質(zhì)量分數(shù)(%)：葡萄糖1.0，(NH4)2SO40.05，NaCl 0.03，KCl 0.03，MgSO4·7H2O 0.03，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.003，MnSO4·H2O 0.003，磷礦粉0.5，pH 7.0～7.5.

表1 菌落形態(tài)描述

圖1 候選菌解磷能力測定

1.3 土壤解磷菌的分離

參照文獻[8]利用稀釋倒平板法將土壤分離菌液接到磷酸鈣固體培養(yǎng)基的平板上，37℃倒置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長情況及其對無機磷的利用狀況和透明圈的有無等等.

將在磷酸鈣固體培養(yǎng)基上分離到的生長較快的菌株涂布在磷礦粉固體培養(yǎng)基平板上，觀察比較各菌的生長狀況，記錄結(jié)果.根據(jù)將分離的菌落重新畫線，涂布，鏡檢，至菌體形態(tài)一致為止，將菌株用磷礦粉固體培養(yǎng)基斜面進行保藏.選得5個能在選擇培養(yǎng)上生長的菌株，并分別命名為DPB1、DPB2、 DPB3、DPB4和DPB5.

1.4 種子液的制備與液體發(fā)酵

將初篩的各個菌落進行活化后接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間以48 h為宜，然后將斜面上的菌落全部刮入100 ml生理鹽水中，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min，37℃振蕩2 h.

試驗設(shè)對照組和實驗組，每種菌種設(shè)三個重復(fù)，將在生理鹽水中稀釋的菌種以10%的接種量接入盛有100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，對照組接入10%的無菌生理鹽水，在旋轉(zhuǎn)式搖床上200 r/min,37℃振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為7 d.

1.5 發(fā)酵液中有效磷含量的測定

參照文獻[9]的方法進行.

1.6 解磷菌DPB5的鑒定

參照文獻[8]進行革蘭氏染色、芽孢觀察.參照文獻[10]進行NaCl試驗、溫度生長試驗、V-P測定、明膠液化實驗、淀粉水解、接觸酶測定、 pH耐受性測定、甲基紅反應(yīng)、脲酶反應(yīng)等生理生化鑒定.

2 結(jié)果與討論

2.1 解磷菌的菌落形態(tài)與篩選

以磷酸鈣固體培養(yǎng)基為篩選培養(yǎng)基，采用稀釋倒平板法從磷礦表層土壤中分離到5個生長旺盛的典型菌落(命名見1.3)，各菌落表觀形態(tài)描述見表1.

各菌種降解磷礦的情況見圖1，從此圖可以看出：對照組、DBP1、DBP3相差不大，但DBP5的解磷能力比對照組及DBP1和DBP3兩個菌株大2倍多，比解磷能力較差DBP2和DBP4兩個菌株分別高出4.5和2.6倍，并且在從外觀也可以看出：DBP5的發(fā)酵液顏色較淺，發(fā)酵液表層的菌膜較多，其它的相對來說顏色要深一點，發(fā)酵液表層的菌膜也相對較少.因此，選擇了DBP5作為降解磷礦的優(yōu)勢菌種，并對該菌株進行了初步鑒定.

2.2 DPB5的鑒定

根據(jù)DBP5的生理生化試驗結(jié)果，由《常見細菌鑒定手冊》[10]初步確定為芽孢桿菌屬(見表2)的枯草芽孢桿菌(B.licheniformis).芽孢桿菌屬(Bacilluscohn)的細菌學(xué)特性為：細胞呈直桿狀，0.5～2.5 μm×1.2～10 μm，常以成隊或鏈狀排列，具圓端或方端.細胞染色大多數(shù)在幼齡培養(yǎng)時呈現(xiàn)革蘭氏陽性，以周生鞭毛運動.芽孢橢圓、卵圓、柱狀、圓形，能抗許多不良環(huán)境.每個細胞產(chǎn)一個芽孢，生孢不被氧所抑制.好氧或兼性厭氧，具有對熱，pH和鹽各種各樣的生理特性.化能異養(yǎng)菌，具有發(fā)酵或呼吸代謝類型.通常接觸酶陽性.發(fā)現(xiàn)于不同的生境，少數(shù)種對脊椎動物和非脊椎動物致病.

3 小結(jié)

試驗篩選出解磷能力較強的菌株為DBP5菌株，經(jīng)過常規(guī)的生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)該菌株為芽孢桿菌屬Bacillus的枯草芽孢桿菌B.subtilis.枯草芽孢桿菌具有生長速度快、抗逆性好、穩(wěn)定性強及能有效抑制有害菌生長等特點[11]，對其具有解磷能力卻鮮見報道，對其解磷機理有待于進一步研究.

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