桐粕降解菌DBTM6培養(yǎng)條件及降解酶活性的研究

周毅峰，鄧桂芳，秦恩華

(湖北民族學院 生物科學與技術學院，湖北 恩施 445000)

油桐(Verniciafordii)是大戟科油桐屬木本植物，其主要產(chǎn)品是桐油，桐粕則是油桐籽榨取桐油后所剩余的副產(chǎn)品，桐粕中蛋白質(zhì)含量為36.29%～45%(浸出法生產(chǎn))，與菜籽餅粕相近，但由于含有皂苷、二萜類、佛波醇等毒素而不能高效利用[1].長期以來人們主要將其當作餅肥還田，由于餅肥在自然發(fā)酵情況下，其腐解程度完全受自然季節(jié)氣候條件和時間的制約，故難以控制達到發(fā)酵餅肥腐解程度的質(zhì)量，氮肥供應期延后.施用微生物發(fā)酵餅肥可改善作物的生長發(fā)育，從而改善作物品質(zhì)[2].因此，通過桐粕降解菌對桐粕進行發(fā)酵，產(chǎn)生的蛋白酶、纖維素酶和果膠酶等酶類將其中大分子物質(zhì)降解為作物易吸收的小分子物質(zhì)，是將桐粕開發(fā)成農(nóng)作物的專用有機肥或生物有機肥的關鍵之一.本文在課題組前期研究基礎之上，對已篩選出的桐粕降解菌DBTM6培養(yǎng)條件進行優(yōu)化[3]，并對DBTM6菌生長代謝過程中產(chǎn)生的酶的活性進行初步研究，使之能夠更好的運用于生產(chǎn).

1 材料與方法

1.1 菌株來源

桐粕降解菌(由原文獻的DBPTF1更名為DBTM1)由課題組分離保存，初步鑒定為白色短小桿菌(Curtobacteriumalbidum)[3].

1.2 培養(yǎng)基及原料來源

斜面完全培養(yǎng)基各成分質(zhì)量分數(shù)(%)：牛肉膏0.5，蛋白胨1.0，氯化鈉0.5，瓊脂2.0，pH7.2～7.5[4].

原料來源：玉米粉、土豆粉，購于菜市場；桐粕：由來鳳縣四海貿(mào)易有限責任公司提供，經(jīng)丙酮脫脂后，80℃烘干，磨研，過60目篩，備用.

1.3 種子液的制備

將桐粕降解菌DBTM6從保存的斜面菌種轉(zhuǎn)接于新鮮斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.取一支培養(yǎng)好的斜面菌種，加入5 mL無菌水，用接種環(huán)將菌苔輕輕刮下，振蕩，無菌水傾注于另一盛有20 mL無菌水的250 mL三角瓶(盛有數(shù)粒玻璃珠)中.然后置搖床上以160 r/min振蕩20 min，制成均勻菌懸液，4℃保存?zhèn)溆?

表1 正交實驗因素水平表(L934)

1.4 單因素試驗

最佳C源的篩選：以玉米粉、土豆粉、蔗糖、葡萄糖為待選C源，培養(yǎng)基各成分質(zhì)量百分數(shù)為：C源2.0，蛋白胨0.5，NaCl 0.5，pH 6.5～7.0，各種培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)速4 800 r/min下離心20min后使用. 按1%(v/v) 接種到100 mL培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h.每種培養(yǎng)基做3個平行，一個對照.

最佳N源的篩選：以蛋白胨、尿素、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸氫銨為待選N源，培養(yǎng)基各成分質(zhì)量百分數(shù)為：N源0.5，蔗糖1.0，NaCl 0.5，pH6.5～7.0. 按1%(v/v) 接種到100 mL培養(yǎng)基中，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h.每種培養(yǎng)基做3個平行，一個對照.

最適溫度的篩選：培養(yǎng)基成分為(%)：玉米粉2.0，蛋白胨0.5，NaCl 0.5 ，pH 6.5～7.0.按1%(v/v) 接種到100 mL培養(yǎng)基中，分別在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃溫度條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h.各種溫度做3個平行，一個對照.

最適初始pH的篩選：分別制成pH為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5的系列培養(yǎng)基，其成分同最適溫度篩選的培養(yǎng)基. 按1%(v/v) 接種到100 mL培養(yǎng)基中，于37℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h.每種pH的培養(yǎng)基做3個平行，一個對照.

最適轉(zhuǎn)速的篩選：按1%(v/v) 接種到100 mL培養(yǎng)基中，其成分和初始pH同最適溫度篩選的培養(yǎng)基. 置搖床中分別于不同轉(zhuǎn)速(120，150，180，210，240，270 r/min)下，37℃振蕩培養(yǎng)16 h.每種轉(zhuǎn)速做3個平行，一個對照.

1.5 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結果，進行3水平4因素正交實驗，選出桐粕降解菌DBTM6的最適生長條件.其正交實驗因素水平表(L934)如表1所示.

1.6 生長量與生長曲線的測定

生長量的測定參照文獻[4]進行；在最適培養(yǎng)條件下液體培養(yǎng)細菌，參照文獻[4]測定不同時段的生長量，并繪制生長曲線.

1.7 粗酶液的桐粕降解活性測定

1.7.1 粗酶液的制備 將桐粕降解菌DBTM6的菌懸液按1%的接種量接種到最適培養(yǎng)基中.并在最適培養(yǎng)條件下振蕩培養(yǎng)16 h.取出發(fā)酵液，10 000 r/min，4℃離心10 min，取上清液.加硫酸銨4℃鹽析過夜.10 000 r/min，4℃離心10 min，棄上清，將沉淀用少量水洗入透析袋中，透析，至BaCl2反應為陰性.將透析袋中的溶液完全轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容至刻度，該溶液即為粗酶液.

1.7.2 酶解反應 取0.6 g桐粕粉于10 mL離心管中，加入6 mL粗酶液，于37℃恒溫水浴鍋中反應1 h，反應過程中不時振搖離心管，反應結束立即置于沸水浴中終止反應，并做三組平行.同時做對照試驗.

圖1 不同碳源對DBPTF6菌生長的影響

圖2 不同氮源對DBPTF6菌生長的影響

表2不同C源對DBTM6菌生長影響的方差分析(n=3，α= 0.01)

Tab.2 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 by adding varieties of carbon(n=3，α=0.01)

差異源SSdfMSFP-valueFcrit組間1.325630.44191164.74062.45×10-616.6944組內(nèi)0.001540.0004總計1.32717

圖3 不同溫度對DBPTF6菌生長的影響

1.7.3 酶活性的分析檢測方法 取出樣品管和對照管冷卻至室溫后，5 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清液即為酶解液.酶解液中蛋白質(zhì)含量的測定：考馬斯亮藍G-250法[5]；半乳糖醛酸含量測定：咔唑比色法[6]；可溶性氮含量測定：凱氏定氮法[6]；還原糖含量測定：3,5-二硝基水楊酸比色法[7].

2 結果與分析

2.1 最佳C源的篩選

為了解桐粕降解菌DBTM6的最佳培養(yǎng)條件，對影響DBTM6菌生長重要的營養(yǎng)成分碳源進行了篩選，結果見圖1.利用Excel軟件對不同碳源培養(yǎng)組間OD600值的差異分析發(fā)現(xiàn)(見表2)：在α=0.01的精度水平上，不同碳源處理組間F值遠遠大于F臨界值，P值為2.45×10-6，證明加不同碳源對桐粕降解菌DBTM6生長有顯著的影響. 利用SPSS軟件對不同氮源培養(yǎng)組間的OD600值進行平均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：當培養(yǎng)基選擇不同C源時，各處理組的培養(yǎng)液光密度(OD600)有顯著性差異；培養(yǎng)基選擇玉米粉作為C源與其他C源相比，對DBTM6菌株生長的有極顯著性影響，發(fā)酵后培養(yǎng)液的光密度最高達到1.780 7.另外，玉米粉是DBTM6菌在設定條件下發(fā)酵生產(chǎn)的最適碳源.

2.2 最佳N源的篩選

對影響DBTM6菌生長重要的營養(yǎng)成分氮源進行了篩選，結果見圖2.利用Excel軟件對不同氮源培養(yǎng)組間OD600值的差異分析發(fā)現(xiàn)(見表3)：在α=0.01的精度水平上，不同氮源處理組間F值遠遠大于F臨界值，P值為1.7711×10-9，證明不同N源對桐粕降解菌DBTM6生長有顯著的影響.利用SPSS軟件對不同氮源培養(yǎng)組間的OD600值進行平均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：當培養(yǎng)基中N源為小分子氮源(尿素)、硝態(tài)氮(硝酸鉀)和氨態(tài)氮(硫酸銨、碳酸氫銨)時，對DBTM6菌株的生長無顯著性影響；當培養(yǎng)基中N源為大分子氮(蛋白胨)時，其發(fā)酵培養(yǎng)液的OD600值最大，達到1.560 0，說明大分子氮源是最適合DBTM6菌株生長的，并其作用與其余四組相比存在極顯著性差異.故本研究采用蛋白胨作為種子培養(yǎng)基的N源.

2.3 最適溫度的篩選

溫度主要通過改變酶反應速率來影響菌體的生長.為了解DBTM6菌的最適生長溫度，對DBTM6菌進行了不同溫度的培養(yǎng)試驗，結果見圖3.利用Excel軟件對不同溫度培養(yǎng)組間OD600值的差異分析發(fā)現(xiàn)(見表4)：在α=0.01的精度水平上，不同溫度處理組間F值遠遠大于F臨界值，P值為6.3712×10-5，證明不同溫度對桐粕降解菌DBTM6生長有極顯著的影響.利用SPSS軟件對不同溫度培養(yǎng)組間的OD600值進行平均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：當培養(yǎng)溫度為35℃、40℃、45℃時，各組培養(yǎng)液的OD600值無顯著性差異，在30℃和50℃時有顯著性差異，菌體生長相對較差，45℃培養(yǎng)液的光密度最大，達到2.051 0.因此，DBTM6菌生長較適合的培養(yǎng)溫度為35℃～45℃.

表4 溫度對DBTM6菌生長影響的方差分析(n=3，α=0.01)

圖4 不同pH值對DBPTF6菌生長的影響

表5初始pH對DBTM6菌生長影響的方差分析(n=3，α=0.01)

Tab.5 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 in varieties initial pH conditions(n=3，α=0.01)

差異源SSdfMSFP-valueFcrit組間0.804970.11503.29050.05856.1776組內(nèi)0.279680.0349總計1.084515

圖5 不同轉(zhuǎn)速對DBPTF6菌生長的影響

表6轉(zhuǎn)速對DBTM6菌生長影響的方差分析(n=3，α=0.01)

Tab.6 The variance analysis of influence for the growth of DBTM6 in different speed conditions(n=3，α=0.01)

差異源SSdfMSFP-valueFcrit組間1.940550.388124.23786.5272×10-48.7459組內(nèi)0.096060.0160總計2.036511

2.4 最適初始pH的篩選

培養(yǎng)基初始pH的變化會影響接種后菌體生長的延遲期和生長速率，進而影響最終菌體濃度.為了解DBTM6菌的最適初始pH值，對DBTM6菌進行了不同pH值的培養(yǎng)試驗，結果見圖4.利用Excel軟件對不同初始pH值培養(yǎng)組間OD600值的差異分析發(fā)現(xiàn)(見表5)：在α=0.01的精度水平上，各處理組間F值小于F臨界值，P值為0.058 5，證明初始pH值對桐粕降解菌DBTM6的生長無顯著的影響.利用SPSS軟件對不同初始pH值培養(yǎng)組間的OD600值進行平均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：當初始pH值在5.0～6.5時，菌體生長速度較快，因而，初始pH選取5.0～6.5較為合適，其中以pH5.5為最好，其OD600值達到2.303.

2.5 最適轉(zhuǎn)速的篩選

白色短小桿菌的發(fā)酵是需氧性發(fā)酵過程，通過改變搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)通氣量.為了解桐粕降解菌DBTM6的最適培養(yǎng)條件，對影響DBTM6菌生長的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速進行了篩選，結果見圖5.利用Excel軟件對不同轉(zhuǎn)速培養(yǎng)組間OD600值的差異分析發(fā)現(xiàn)(見表6)：在α=0.01的精度水平上，不同轉(zhuǎn)速處理組間F值大于F臨界值，P值為6.527×10-4，證明轉(zhuǎn)速對桐粕降解菌DBTM6的生長有極顯著的影響.利用SPSS軟件對不同初始pH值培養(yǎng)組間的OD600值進行平均數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：當轉(zhuǎn)速在150～270 r/min范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)速每提高30 r/min，對DBTM6菌株生長的影響無顯著性差異，但發(fā)酵液的OD600值隨著轉(zhuǎn)速提高而增大，當轉(zhuǎn)速為120 r/min時，與其它轉(zhuǎn)速相比對DBTM6菌株生長的影響具有顯著性差異，其OD600值最小.裝量和轉(zhuǎn)速是影響搖瓶中溶氧濃度的兩個重要因素，在裝量一定的情況下，在一定范圍內(nèi)轉(zhuǎn)速越高，溶氧濃度越高.轉(zhuǎn)速超過210 r/min后，容易引起菌體自溶.故桐粕降解菌DBTM6的最適轉(zhuǎn)速為210 r/min.

2.6 正交試驗

根據(jù)單因素實驗結果，進行3水平4因素的正交試驗，選出桐粕降解菌DBTM6的最適生長條件，以培養(yǎng)結束時的光密度(OD600)作為考察指標.根據(jù)表7分析，C源和轉(zhuǎn)速是影響DBTM6菌生長較為顯著的因素，根據(jù)極差分析得知對桐粕降解菌DBTM6生長影響的顯著性次序為碳源>轉(zhuǎn)速>pH>溫度，最適生長條件為A1B3C2D2，即玉米粉2.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%，最適溫度為40℃，最適pH為6.0，最適轉(zhuǎn)速為200 r/min.利用最佳的培養(yǎng)條件搖床培養(yǎng)16 h后，得到表現(xiàn)菌體生長情況的OD600值為2.431.

2.7 生長曲線的測定

選擇適當?shù)慕臃N菌齡十分重要，在微生物發(fā)酵工業(yè)中，為縮短發(fā)酵周期，人們往往選擇對數(shù)期的種子進行轉(zhuǎn)種或擴大培養(yǎng)，因此在最適培養(yǎng)條件下測定了DBTM6菌的生長曲線.從圖6可以看出：種子液接入種子培養(yǎng)基4 h后進入對數(shù)生長期；4～14 h細胞呈對數(shù)增長，14 h左右光密度達到最高峰.因此選擇接種種齡為12～14 h，此時菌體處于生命力極為旺盛的對數(shù)生長期后期，既可保持高的細胞活力，又可獲得盡可能多的細胞數(shù)目.

表7 搖瓶培養(yǎng)正交試驗結果(L934)

圖6 DBPTF6菌株種子生長曲線

2.8 桐粕降解酶活性的初步研究

桐粕中含有豐富的纖維素、蛋白質(zhì)及果膠物質(zhì)[8]，為了使作物對其進行快速有效的吸收利用，需要對桐粕進行降解.為此，課題組在前期的研究中分離得到DBTM1和DBTM6兩個優(yōu)良菌株[3]，并發(fā)現(xiàn)DBTM6兼具有對桐粕纖維素降解活力、果膠物質(zhì)降解活力及蛋白質(zhì)降解酶活力.為了解DBTM6菌對桐粕纖維素降解能力，在DBTM6菌最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)生了粗纖維酶酶液，并進行了桐粕纖維素降解試驗.纖維素酶活力單位定義在37℃條件下，每分鐘降解桐粕產(chǎn)生1 μg葡萄糖為一個纖維素酶活力單位.其比活力定義為：每毫克酶蛋白所具有的纖維素酶活力單位數(shù)，以“U/mg”為單位.通過3,5-二硝基水楊酸比色法測定了反應液中還原糖的含量，得到該粗酶液的纖維素酶活力為3.571 7 U/mL，比活力為13.854 5 U/mg.

本文通過咔唑比色法測定了反應液中的半乳糖醛酸含量，得到該粗酶液的果膠酶活性為1.141 5 U/mL，比活力為4.427 9 U/mg.同樣，通過凱氏定氮法測定了反應液中的可溶性氮的含量，得到該粗酶液的蛋白酶活性為36.358 3 U/mL，比活力為141.033 1 U/mg.

3 結論

本文采用單因素試驗和正交試驗選出了DBTM6菌的最佳培養(yǎng)基成分為：玉米粉2.0%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.5%；最適培養(yǎng)條件為：溫度為40℃，pH為6.0，轉(zhuǎn)速為200 r/min.

在最適培養(yǎng)條件下測定了DBTM6菌的降解桐粕纖維素酶活力為3.571 7 U/mL，降解桐粕果膠酶活力為1.141 5 U/mL，降解桐粕蛋白酶活力為36.358 3 U/mL，三種酶的比活力分別為13.854 5，4.427 9，141.033 1 U/mg.桐粕降解菌DBTM6含有較豐富的酶系，在其發(fā)酵桐粕過程中，各種酶活力影響桐粕降解物的得率以及腐熟桐粕施入土壤后的利用率，因此研究其酶活性是非常必要的，為桐粕更好的運用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù).

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