發(fā)酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的初步研究

梁盛年

(肇慶學院 生命科學學院，廣東 肇慶 526061)

0 引言

植物蛋白具有許多生理功能.例如：對肝硬化患者具有營養(yǎng)支持作用；能降低膽固醇水平；能減少癌癥的發(fā)生；還能夠改善腎臟病和心血管疾病的癥狀等.隨著科技的進步，植物蛋白[1]的功能不斷被揭示并得到發(fā)展.我國植物蛋白資源豐富，每年以大豆、花生、油菜籽、棉籽等為原料的油料產(chǎn)品約達1.4億t，這些均為較好的植物蛋白資源.植物蛋白的開發(fā)利用有很多途徑，近幾年人們研究得最多的是棉籽[2]、菜籽[3]、大豆[4]等幾種植物的蛋白水解.植物蛋白的水解方法主要有酸法、堿法和酶法[5－6].堿法和酸法工藝中的最終產(chǎn)物需中和反應，因鹽的濃度太高，不利于使用.采用酶法進行水解，產(chǎn)品的顏色和味道優(yōu)于堿法和酸法[2]38.本文中，筆者通過探討微生物發(fā)酵法酶解植物蛋白在不同溫度、不同物料比和不同水解時間條件下發(fā)酵液的水解度，即蛋白質(zhì)的消化率，尋求較好的水解條件，為微生物發(fā)酵法酶解植物蛋白的生產(chǎn)工藝提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

S13菌株，能產(chǎn)堿性蛋白酶，由肇慶學院生命科學學院微生物實驗室提供.

1.1.2 菜籽粉

本實驗所用的菜籽餅在飼料市場中購得，油菜籽榨油后的餅塊粉碎成粉狀作為菜籽粉，約含20%～30%的蛋白質(zhì).

1.1.3 培養(yǎng)基[7]

1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1.0 g，NaC l0.5 g，100 mL蒸餾水，pH值為9.5.

2）發(fā)酵培養(yǎng)基：體積分數(shù)為1.5%的葡萄糖，體積分數(shù)為1.0%的酵母浸膏，Na2HPO40.4 g，NaCO30.3 g，KH2PO40.03 g，蒸餾水100 mL,pH值為9.5.

1.1.4 化學試劑

1）硫酸銅，硫酸鉀，硫酸，硼酸溶液（20 g/L）和氫氧化鈉溶液（400 g/L）.

2）0.010 5 mol/L鹽酸標準溶液，0.047 3 mol/L NaOH標準溶液，體積分數(shù)為36%的甲醛溶液.

3）體積分數(shù)為0.1%的甲基紅乙醇溶液1份，體積分數(shù)為0.1%的溴甲酚綠乙醇溶液5份，臨用時將它們混合在一起.

1.1.5 實驗儀器

實驗所用儀器如下：標準型雙人凈化工作臺；自動回流消化儀；微量凱氏定氮裝置；干燥箱（101－1型）；微型植物粉碎機（FZ102型）；電子天平（JA5003N）；磁力加熱攪拌器（79－1）；pH計（PHS－3C型）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（SKY－200B型）；隔熱式電熱恒溫培養(yǎng)箱（PYX－DHS）.

1.2 方法

1.2.1 凱氏定氮法測定菜籽粉中的蛋白質(zhì)含量

按文獻[8]中的方法將樣品進行消化、蒸餾、滴定，并計算出菜籽粉中的蛋白質(zhì)含量.

1.2.2 S13菌株活化及擴大培養(yǎng)

將斜面保藏的S13菌株接種到牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，在37℃的溫度下活化培養(yǎng)24 h后再擴接到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角燒瓶中，調(diào)好pH值，并用恒溫培養(yǎng)振蕩器在37℃的溫度下振蕩培養(yǎng)24 h，菌液待用.

1.2.3 酶解條件及方法

取5個500 mL的三角燒瓶，分別加入5 g菜籽粉，再按1:10，1:20和1:30的比例分別加入50 mL，100 mL，150 mL的菌液搖勻；置于恒溫培養(yǎng)振蕩器上，在32℃的溫度及180 r/min的條件下恒溫振蕩水解6 h（振蕩水解過程維持pH值不變），取出，加熱作酶鈍化；將水解液過濾，作為測定蛋白質(zhì)消化率的待測液.

按上述操作方法，再分別作35，37，40，42℃4種溫度及180 r/min條件下12，24，32 h的恒溫振蕩水解，水解液作相同處理.以不加菌液作相同條件處理的水解液作為空白對照.

1.2.4 電位滴定法測定氨態(tài)氮[9]

1）吸取待測液5.0 mL加水定容至100 mL作為試樣液.2）吸取20 mL置于100 mL燒杯中，再加入70 mL蒸餾水.3）燒杯放到磁力攪拌器上，插入酸度計，開啟攪拌器，用氫氧化鈉溶液進行滴定，使溶液pH值達到8.2，記錄消耗氫氧化鈉溶液的體積.4）加入10.0 mL甲醛溶液，混勻，用氫氧化鈉溶液進行滴定，使溶液的pH值為9.2，記錄消耗氫氧化鈉溶液的體積V3.5)量取空白對照液作同樣測定,得消耗氫氧化鈉溶液的體積V4.計算公式如下：

其中，X3：樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，g/L；V3：測定樣品在加入甲醛后滴定至終點（pH值為9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V4：空白對照液加入甲醛后滴定至終點（pH值為9.2）所消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；N：氫氧化鈉標準溶液的濃度，mol/L；0.014：與1 mL氫氧化鈉標準溶液相當?shù)牡馁|(zhì)量，g.

1.2.5 蛋白質(zhì)消化率的計算方法

蛋白質(zhì)的消化率＝X3與菜籽粉總氮之比，可以用如下公式計算：

其中，X3：樣品中氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量濃度，g/L.

2 結果與分析

2.1 菜籽粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)測定

用凱氏定氮法測得菜籽粉中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)為25.52%.

2.2 不同酶解條件下菜籽粉中蛋白質(zhì)的消化率

按實驗預設的方法分別做了物料比為1:10，1:20，1:30，溫度為32，35，37，40和42℃，水解時間為6，12， 24和32h的水解實驗，實驗結果見表1、表2和表3.

表1 不同溫度條件下，物料比為1:10時處理氨態(tài)氮的消化率比較

表2 不同溫度條件下，物料比為1:20時處理氨態(tài)氮的消化率比較

表3 不同溫度條件下，物料比為1:30時處理氨態(tài)氮的消化率比較

從表1～3的結果可以看出，用S13菌株培養(yǎng)液酶解菜籽粉中的植物蛋白呈現(xiàn)一定的規(guī)律性:即消化率隨物料比的提高而增大；它也隨溫度的升高而增大，到37℃時達到峰值，然后隨溫度升高反而下降；消化率隨水解時間延長而不斷增大，但24h后趨勢變得很緩慢，水解率增加不大.據(jù)此，可初步確定37℃和24h為較適宜的水解條件.為進一步弄清物料比對消化率的影響，筆者補做了在37℃和24h的水解條件下，物料比為1:40和1:50時的水解實驗，結果見表4.

表4 不同物料比處理氨態(tài)氮的消化率比較

從表4結果可見,當物料比進一步增大時,消化率反而下降,由此可認為物料比為1:30是較適宜的水解條件.至于水解時間對消化率的影響，從能耗方面考慮，筆者認為選24h比較適宜.

S13菌株為一桿狀細菌，37℃為其最適宜的生長溫度，培養(yǎng)24h達到生長對數(shù)期.將S13菌株用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，在酶活力最高時將其與菜籽粉混合，讓發(fā)酵液中的堿性蛋白酶直接作用于菜籽粉中的植物蛋白，將其酶解為多肽，能取得較佳的水解效果.

3 結論與討論

用S13菌株培養(yǎng)液酶解菜籽粉中的植物蛋白，較好的反應條件為：溫度為37℃，物料比為1:30，經(jīng)24h恒溫搖床振蕩水解，所得蛋白質(zhì)的消化率可達16.61%.

本實驗得到的蛋白質(zhì)的消化率約為16%，與文獻[6]所報道的酶解結果比較，消化率偏低.其原因是文獻[6]中使用的是純酶，酶活性較高；而本實驗是直接用產(chǎn)酶菌株培養(yǎng)24h后所產(chǎn)的蛋白質(zhì)酶做酶解實驗，所產(chǎn)的酶未經(jīng)提純，酶活性較低，因而所得蛋白質(zhì)的消化率也較低.但與文獻[3]中的酶解結果比較，本實驗所得蛋白質(zhì)的消化率高2%.這表明，直接應用能產(chǎn)蛋白酶的微生物進行植物蛋白水解的方法應有可取之處.本實驗采取的方法具有操作簡單、成本低、水解快速及重現(xiàn)性好等優(yōu)點，它為進一步探索微生物發(fā)酵法酶解菜籽粉中植物蛋白的生產(chǎn)工藝提供了依據(jù).

[1] 陳貴堂,趙霖.植物蛋白的營養(yǎng)生理功能及開發(fā)利用[J].食品工業(yè)科技,2004(9):137-139.

[2] 郭城,鄭競成.酶法水解棉籽蛋白的研究[J].中國油脂,2007,32(8):38-40.

[3] 周鴻翔,邱樹毅,楊洪丹,等.風味蛋白酶水解菜籽蛋白條件研究[J].食品工程,2009(2):32-34.

[4] 盧楠,雷瑩,郭立達.酶法水解大豆分離蛋白的研究[J].河北師范大學學報：自然科學版,2009,33(4):499-514.

[5] 范恒君.酶法水解植物蛋白[J].南寧職業(yè)技術學院學報,2000,3(5):57-61.

[6] 李樹品,李梅,蔣千里.植物蛋白的酶法水解[J].山東科學,1997,1(3):53-56.

[7] 沈萍,范秀容,李廣斌.微生物學實驗[M].北京:高等教育出版社,1999:50-51.

[8] 張水華.食品分析實驗[M].北京:化學工業(yè)出版社,2006:45-47.

[9] 王叔淳.食品衛(wèi)生檢驗技術手冊[M].2版.北京:化學工業(yè)出版社,1994：101-107.