擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DAZ基因的分離和cDNA序列分析

趙文娟,朱建軍,呂廷德,薄新文,王新華

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832000;2新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832000)

擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DAZ基因的分離和cDNA序列分析

趙文娟1,2,朱建軍1,2,呂廷德1,2,薄新文2,王新華2

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832000;2新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832000)

為進(jìn)一步研究擴(kuò)展莫尼茨絳蟲并以其作為模式生物提供基礎(chǔ)。通過構(gòu)建的擴(kuò)展莫尼茨絳蟲成蟲cDNA文庫,隨機(jī)挑取重組陽性克隆進(jìn)行測(cè)序,對(duì)部分序列進(jìn)行引物步移法測(cè)序,獲取其全長cDNA序列;采用生物信息學(xué)等技術(shù)對(duì)該cDNA序列進(jìn)行開放閱讀框(ORF)的尋找、編碼氨基酸的推導(dǎo)、核苷酸和氨基酸同源性比較以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示:獲得了1個(gè)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲新基因 DAZ基因,cDNA全長1905bp,包含1個(gè)完整的ORF,編碼562個(gè)氨基酸,登錄號(hào)為:GH291478。蛋白理論分子量為61.3169kD,等電點(diǎn)為4.77,不穩(wěn)定系數(shù)50.27,脂肪系數(shù)65.04,總平均親水性-0.472。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該蛋白有1個(gè)跨膜區(qū)域,以無規(guī)卷曲(L)為主,沒有二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。本研究成功分離擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DAZ基因。

擴(kuò)展莫尼茨絳蟲;DAZ基因;序列分析

莫尼茨絳蟲、細(xì)粒棘球絳蟲和日本血吸蟲同屬于扁形動(dòng)物門,并且在新疆地區(qū)分布廣泛,有良好的材料來源。因此,利用莫尼茨絳蟲來研究對(duì)人類危害更大的人畜共患的寄生蟲病,可以有效的減少實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的危害。莫尼茨絳蟲有發(fā)達(dá)的生殖系統(tǒng),每一成熟的節(jié)片內(nèi)有兩套成熟的生殖系統(tǒng)[1],以莫尼茨絳蟲為模式生物來研究其他生物甚至人類生殖疾病的發(fā)生與治療,成為當(dāng)前科研工作者的重要研究課題。

無精癥缺失基因(deleted in azoospermia gene,DA Z)定位于 Y染色體長臂無精癥因子c區(qū) (azoospermia factor c,AZFc),在大多數(shù)個(gè)體中有4種拷貝 ,分別被命名為 DAZ1、DAZ2、DAZ3 和 DAZ4[2]。有研究表明,DA Z基因在睪丸組織中特異表達(dá),其產(chǎn)物為RNA結(jié)合蛋白,可能在生精過程中發(fā)揮著重要作用[3]。DA Z基因的全部拷貝缺失已被普遍認(rèn)為是生精障礙的重要遺傳病因。近年來,有文獻(xiàn)報(bào)道,DA Z部分拷貝缺失的某些類型也與人類的生精障礙有關(guān)[4,5]。

本文從擴(kuò)展莫尼茨絳蟲克隆得到 DA Z基因,通過序列分析了解此基因在絳蟲的理化性質(zhì),尋找保守序列,以期為利用其作為模式基因研究其他物種的相關(guān)疾病奠定分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 擴(kuò)展莫尼茨絳蟲cDNA文庫

由新疆兵團(tuán)綿羊繁育生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。該文庫采用smart cDNA技術(shù)構(gòu)建,以凍干質(zhì)粒形式保存。其包裝效率為1.01×106pf u/mL,插入片段平均長度為1.39kb左右,重組率在94.7%以上。

1.1.2 載體及宿主菌

載體:pBluescript II SK＊,可用于 DNA的表達(dá);宿主菌:大腸埃希菌DH5α。

1.1.3 引物

測(cè)通全長用通用引物 M13和特定引物 5′-CCAACGTTA TGA TCTGCACC-3′。所有引物均由上海生工有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 cDNA文庫的轉(zhuǎn)化及篩選

將大腸桿菌DH5α接種于LB培養(yǎng)基中,37℃,220r/min振搖培養(yǎng)2h后,用 CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞。加入2μL原文庫,混勻,冰浴 30min,42℃熱休克90s,立即冰浴 2min,加LB培養(yǎng)基 800μL,37℃120r/min振搖 1h,13000r/min離心 30s,去上清。將沉淀涂布于含100μg/mL氨芐青霉素、200mg/L IPTG、20mg/L X-gal的固體LB瓊脂培養(yǎng)基中鋪板,37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.2 陽性克隆的分離及測(cè)序

挑取單個(gè)白色菌落,用 X-gal再次篩選后并擴(kuò)增,用天根質(zhì)粒DNA純化試劑盒提取質(zhì)粒。于ABI377型自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行DNA序列測(cè)定(由上海生工有限公司協(xié)助完成)。

1.2.3 新基因的獲取與序列分析

將上述原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后,在線進(jìn)行Blast分析,得到擴(kuò)展莫尼茨絳蟲新的 EST并登錄GenBank。根據(jù)EST分析結(jié)果分配克隆重疊群,分析與拼接克隆重疊群,對(duì)拼接后的序列用 Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)步移法測(cè)序引物。

用上述測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序直至出現(xiàn)PolyA,將原始測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯后獲得新基因的全長cDNA序列。通過 NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi nih.nlm.gov/blast X)與其他物種的同源蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析,利用DNAMAN進(jìn)行多序列聯(lián)配和種系進(jìn)化樹分析;利用開放閱讀框探尋器(ORF finder)確定其完整編碼序列并顯示其編碼的氨基酸序列。

用蛋白分析專家系統(tǒng)服務(wù)器 Ex PASy Proteomics Server(http://ca.expasy.org/)所提供的蛋白質(zhì)在線分析工具,如protparam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)預(yù)測(cè)氨基酸序列的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、穩(wěn)定性指數(shù)等理化性質(zhì),Inter Pro Scan (http://www.ebi.ae.uk/Inter-Pro Sean/)和Motif Scan(http://myhits.isb-sbi.ch/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測(cè)氨基酸序列中的基序(motif)和功能域;用 Predict Protein (http://cubic.bloc.columbia.edu/predictprotein/)預(yù)測(cè)氨基酸序列的跨膜區(qū)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)、用 SWISSMODEL(http://swiss-model.expasy.org/)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上的三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模,預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAZ基因的cDNA序列

該基因cDNA全長1905bp,包含1個(gè)完整的ORF,從142bp到1830bp的位置,編碼562個(gè)氨基酸,終止密碼子 TAA出現(xiàn)于1827bp處,3′端含有polyA尾(圖1)屬于RRM超家族。

圖1 DAZ基因的cDNA序列Fig.1 cDNA sequence of DAZ gene

2.2 蛋白序列比對(duì)

將擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DAZ基因的蛋白序列和NCBI數(shù)據(jù)庫里的蛋白進(jìn)行比對(duì),選取日本血吸蟲(Schistosoma japonicum),日本三角渦蟲(Dugesia japonica)、斑馬魚(Danio rerio)、褐家鼠(Rattus norvegicus)、牛(Bos taurus)、大西洋鮭(Salmo Salar)、雞(Gallus gallus)、人類(Homosapiens)、黑腳硬蜱 (Ixodes scapularis),爪蟾(Xenopus(Silurana)tropicalis)、小白鼠 (Mus musculus)、擴(kuò)展莫尼茨絳蟲(Moniezia expansa)的基因進(jìn)行蛋白序列比對(duì)(圖2)。

在14～21和121～125的位置存在明顯的保守區(qū)域,各物種都為穩(wěn)定的表達(dá),蛋白比對(duì)的一致性為45.75%。

2.3 蛋白理化特性

擴(kuò)展莫尼茨絳蟲該蛋白理論分子量為61.3169 kD,等電點(diǎn)為4.77,不穩(wěn)定系數(shù)50.27,大于閾值40則性質(zhì)不穩(wěn)定,脂肪系數(shù)65.04,總平均親水性-0.472(圖3),蛋白總體疏水性較高。含有10個(gè)半胱氨酸,假設(shè)全部形成二硫鍵時(shí),280nm處的摩爾消光系數(shù)為53455(mol·cm)-1,0.1%濃度(1g/L)的吸光度(A280)為0.872;假設(shè)二硫鍵全部打開時(shí),280nm處的摩爾消光系數(shù)為52830(mol·cm)-1,0.1%濃度(1g/L)的吸光度(A280)為0.862。在酵母和大腸埃希菌中表達(dá)的半衰期分別大于20h和10h,在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀細(xì)胞體外培養(yǎng)中表達(dá)的半衰期為30h。

圖2 DAZ基因的氨基酸多重序列比對(duì)Fig.2 Amino acid multiple sequence alignment of DAZ gene

圖3 DAZ基因的親水性預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophilicity prediction of DAZ gene

2.4 DAZ基因結(jié)構(gòu)的特征性序列、蛋白質(zhì)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)

通過Motif Scan(http://myhits.isb-sbi.ch/cgi-bin/motif_scan)在線預(yù)測(cè)DAZ基因有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn),分別位于堿基的:45～48,404～407,507～510,554～557位;1個(gè)氨基葡聚糖附著位點(diǎn)位于堿基的51～54位;5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),分別位于堿基的:47～49,69～71,112～114,474～476,529～531位;12個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn),分別位于堿基的:2～5,188～191,194～197,208～211,237～240,248～251,468～471,474～477,508～511,512～514,523～526,534～537位;1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)位于堿基的531～538位;10個(gè)N-十四(烷)?；稽c(diǎn),分別位于堿基的:6～11,16～21,199～204,225～230,244～249,279～284,254～259,460～465,479～484,555～560位;1個(gè)推定的真核核糖核蛋白(RNP)標(biāo)記的RNA結(jié)合區(qū)位于堿基的138～145位。Htm預(yù)測(cè)該蛋白有1個(gè)跨膜區(qū)域(圖4),位于堿基的265～288位;Sec預(yù)測(cè)α螺旋(H)、β折疊(E)和無規(guī)卷曲(L)的比例分別為15.48∶12.46∶72.06,二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲(L)為主,沒有二硫鍵結(jié)合位點(diǎn)。

圖4 DAZ基因的跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)Fig.4 Trans membrane region prediction of DAZ gene

2.4.5 DAZ基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模

DA Z基因三級(jí)結(jié)構(gòu)建模如圖5所示,模型的構(gòu)建從5～175aa,和其他蛋白的序列最高一致性達(dá)到32%,Evalue值為2.9E-22。

圖5 DAZ基因三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure prediction of DAZ gene

3 討論

擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DA Z基因在線比對(duì)分析屬于RRM超家族,與精子的發(fā)育、雄性的生殖有關(guān)。同其他物種DA Z基因進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì)時(shí),在14～21和121～125的位置存在明顯的保守區(qū)域,各物種都為穩(wěn)定的表達(dá),蛋白比對(duì)的一致性為45.75%。這為我們利用擴(kuò)展莫尼茨絳蟲生殖器官作為模式來研究其它物種相同器官的發(fā)育和病變機(jī)理提供了基礎(chǔ)。目前男性不育癥是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重要問題之一,大約有10～15%的已婚夫婦不能生育,其原因多種多樣,其中精子質(zhì)量和無精子癥基因(Deleted in Azoospermia,DA Z)是 2個(gè)重要因素[6]。而且也有文獻(xiàn)報(bào)道 DAZ基因與男性不育相關(guān),它主要調(diào)控早期生殖細(xì)胞的增殖。DA Z基因簇完全或部分缺失可導(dǎo)致10%不育男性的生殖細(xì)胞減少[7]。DA Z基因家族所有成員只在生殖細(xì)胞表達(dá)[8],但是具體的表達(dá)機(jī)制還不清楚,我們對(duì)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲 DA Z基因的研究可以為研究人類DA Z基因提供模式生物方面的資料。

隨著輔助生育技術(shù)的發(fā)展與ICSI技術(shù)的日益成熟,使嚴(yán)重生精障礙不育患者也能生育后代。可以預(yù)見,在接受 ICSI的夫婦中,越來越多的嚴(yán)重寡精癥患者將被作為精子供體,而研究已表明,精子供體的異常遺傳物質(zhì)可能傳遞給下一代[9,10],所以尋找有效方法檢測(cè)嚴(yán)重寡精癥患者將是一項(xiàng)關(guān)系后代的嚴(yán)峻任務(wù)。但是從研究材料和倫理道德方面看我們不可能直接用人來進(jìn)行試驗(yàn),必須選擇一類來源方便并且基因同源性較高的模式生物進(jìn)行研究。我們通過對(duì)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲 DA Z基因進(jìn)行序列,發(fā)現(xiàn)其與人類的 DA Z基因有高度的同源性,存在穩(wěn)定的保守序列。對(duì)擴(kuò)展莫尼茨絳蟲DA Z基因的分析和功能預(yù)測(cè),更具有了現(xiàn)實(shí)的意義。

擴(kuò)展莫尼茨絳蟲該蛋白理論分子量為61.3169 kDa,等電點(diǎn)為4.77,不穩(wěn)定系數(shù)50.27,脂肪系數(shù)65.04,總平均親水性-0.472,蛋白總體疏水性較高而且很不穩(wěn)定。4個(gè)N-糖基化位點(diǎn),5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),12個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn),1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),10個(gè)N-十四(烷)?；稽c(diǎn),1個(gè)推定的真核核糖核蛋白(RNP)標(biāo)記的RNA結(jié)合區(qū)。Htm預(yù)測(cè)該蛋白有1個(gè)跨膜區(qū)域,Sec預(yù)測(cè)α螺旋(H)、β折疊(E)和無規(guī)卷曲(L)的比例分別為15.48∶12.46∶72.06,二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)卷曲(L)為主。沒有二硫鍵結(jié)合位點(diǎn),三級(jí)結(jié)構(gòu)建模對(duì)DA Z基因的空間構(gòu)型進(jìn)行了形象的預(yù)測(cè)。這些蛋白功能位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)不但說明該條基因有多個(gè)功能位點(diǎn),而且為后續(xù)研究 DAZ基因的功能域結(jié)構(gòu)指明了方向。

我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中得到的 DA Z基因,通過和其他物種DA Z基因的蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)穩(wěn)定表達(dá)的保守序列。DA Z是激活精子生成和保持種族 Y染色體功能的重要基因,我們可以利用擴(kuò)展莫尼茨絳蟲發(fā)達(dá)的生殖系統(tǒng)作為模式生物研究其他物種的生殖疾病。以上結(jié)果表明,我們成功獲得了擴(kuò)展莫尼茨絳蟲 DA Z基因的全長cDNA序列,并對(duì)其cDNA序列和編碼蛋白進(jìn)行B生物信息學(xué)分析,從而為該基因功能的實(shí)驗(yàn)性鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。

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The Isolation and Sequence Analysis of the cDNA Encoding Moniezia expansa Deleted in Azoospermia

ZHAO Wenjuan1,2,ZHU Jianjun1,2,LüTingde1,2,BO Xinwen2,WANG Xinhua2
(1 College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2 Key Laboratory of Sheep Breeding&Biotechnology of XPCC,Shihezi 832000,China)

To provide a foundation for further research even as model organisms,clones were selected randomly from the cDNA library and sequenced by using the method of expression sequence tags(ESTs).Novel genes were acquired by primer-walking.By using bioinformatics,the cDNA sequence encoding M.expansa deleted in azoospermia(DAZ)was analyzed,including searching the ORF,translating the nucleotide to protein sequence,searching similarity and predicting of initial protein structure.The results showed that an new gene of M.expansa-DA Z gene obtained:the full-length of cDNA was 1905bp,a complete ORF encoding 562 amino acids,accession number was GH291478.The academic pIwas 4.77 and molecular weight was 61.3169kDa,instability index:50.27,aliphatic index:65.04,grand average of hydropathicity:-0.472.The conclusion is that:DA Z gene was successfully separated from M.ex pansa.

M.expansa;deleted in azoospermia;sequence analysis

S858

A

1007-7383(2010)01-0037-06

2009-04-19

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃前期研究專項(xiàng)(2006CB708512)

趙文娟(1983-),女,碩士生,專業(yè)方向?yàn)榉肿蛹纳x學(xué);e-mail:zwj-130@163.com。

薄新文(1969-),男,研究員,從事寄生蟲分子生物學(xué)研究;e-mail:boxinwen@yahoo.com.cn。