UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞中beta-catenin基因的變化研究

[摘要]目的:觀察中波紫外線(xiàn)(UVB)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞中β-catenin及其下游基因c-myc的變化，探討其在紫外線(xiàn)誘導(dǎo)光老化和腫瘤發(fā)生中的作用。方法:使用組織塊法分離培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞，使用第2～8代人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行紫外線(xiàn)處理，倒置熒光顯微鏡觀察其形態(tài)學(xué)改變，β-gal半乳糖苷酶細(xì)胞衰老試劑盒染色衰老細(xì)胞、western blot檢測(cè)衰老相關(guān)蛋白P16的表達(dá)，western blot 檢測(cè)紫外線(xiàn)處理人皮膚成纖維細(xì)胞各時(shí)相點(diǎn)β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測(cè)紫外線(xiàn)處理人皮膚成纖維細(xì)胞各時(shí)像點(diǎn)β-catenin、c-myc mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果:40 mJ/cm2UVB單次照射后可以誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老，β-gal衰老染色陽(yáng)性率達(dá)到約90%，衰老相關(guān)基因P16蛋白表達(dá)明顯升高，β-catenin、c-myc 蛋白表達(dá)水平和mRNA水平照射后較未照射組均明顯降低。結(jié)論:紫外線(xiàn)UVB處理人皮膚成纖維細(xì)胞可以誘導(dǎo)其發(fā)生衰老改變，衰老細(xì)胞中β-catenin、c-myc表達(dá)水平明顯降低，這些結(jié)果與皮膚黑色素細(xì)胞瘤相關(guān)基因改變的研究相近，為以后皮膚惡性腫瘤的研究提供了線(xiàn)索。

[關(guān)鍵詞]人皮膚成纖維細(xì)胞;光老化;beta-catenin;c-myc

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455(2010)05-0704-04

The study of beta-catenin change in human fibroblast induced by UVB irradiation

HU Xiao-hui， GAO Feng-hou，F(xiàn)ANG Yong

(Department of Burn Plastics，NO.3 People'Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 201900，China)

Abtract: ObjectiveTo observe the change of beta-catenin and its follow gene c-myc in human fibroblast after induced by UVB，exploure their roles at UVB induced photoaging and cancer.MethodsIsolation and culture human skin fibroblast by tissues methods，fibroblasts were irradiation at different dose UltravioletB，observation the cells'morphology under the invert microscope. Senescence cells were stained by β-galactosidase kit，the level of P16 protein were measured by western blot. The protein and mRNA level of beta-catenin，c-myc by western blot at different time points after UVB irradiation.ResultsFibroblast senescence can be induced by ultravioletB irradiation at 20、40 mJ/cm2，the stain positive ration arrived at about 90%.The protein level of P16 increased obviously following times.The protein and mRNA level of beta-catenin and c-myc decreased obviously after UVB irradiation compared to control.ConclusionThe beta-catenin and c-myc gene decrease in Human skin fibroblasts after induced by ultravioletB irradiation.

Key words: human skin fibroblast;photoaging;beta-catenin;c-myc

紫外線(xiàn)照射以后可以誘導(dǎo)皮膚光老化，導(dǎo)致皮膚變得粗糙、皺紋加深[1]，同時(shí)老化可以限制細(xì)胞的無(wú)限制生長(zhǎng)抑制腫瘤的發(fā)生，臨床上發(fā)現(xiàn)皮膚黑色素細(xì)胞瘤多發(fā)生于非日光暴露部位，是否紫外線(xiàn)在其中起了重要的作用，這其中的機(jī)制還不是十分清楚[2]。有學(xué)者認(rèn)為[3]，光老化是一種癌前狀態(tài)，也有學(xué)者[4]認(rèn)為細(xì)胞衰老是限制細(xì)胞發(fā)生癌變的一種保護(hù)措施。我們的研究通過(guò)紫外線(xiàn)照射正常人皮膚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)其光老化，并對(duì)成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中beta-catenin和c-myc兩個(gè)癌基因的變化進(jìn)行了初步研究。

1材料和方法

1.1 主要試劑和儀器:胎牛血清和高糖DMED培養(yǎng)基(Gbico公司)，0.25%胰酶-0.02%EDTA，β-gal半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒(碧云天公司)，2×SDS蛋白裂解液(碧云天公司)，兔抗人β-catenin抗體，兔抗人P16抗體、兔抗人c-myc抗體(cell signaling)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ig二抗(cell signaling)。Takara RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(大連生工)。Scientz03-II紫外交聯(lián)儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng):我院泌尿外科兒童包皮環(huán)切術(shù)后包皮(患者知情同意)，去除皮下脂肪及血管根據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，采用組織塊法分離獲得包皮成纖維細(xì)胞，高糖DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)，細(xì)胞長(zhǎng)至90%融合后0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代擴(kuò)增。取第2～8代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人成纖維細(xì)胞紫外線(xiàn)誘導(dǎo)光老化:取2～8代人成纖維細(xì)胞使用紫外交聯(lián)儀在312nm中波紫外線(xiàn)(UVB)下照設(shè)，UVB能量在20～40mJ/cm2范圍內(nèi)照設(shè)后48h按700個(gè)細(xì)胞/cm2重新接種于六孔板中，24h候后β-gal半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色試劑盒檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。

1.2.3蛋白印跡檢測(cè)衰老人成纖維細(xì)胞中P16、β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)變化:取2～8代人成纖維細(xì)胞按1×106個(gè)每皿接種于直徑100mm培養(yǎng)皿中，接種后24h細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合，在40 mJ/cm2UVB紫外線(xiàn)下照射，于照射后第0、12、24、48、72h收集細(xì)胞，2×SDS蛋白裂解液裂解細(xì)胞收集蛋白，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，一抗(β-catenin 1:1000，c-myc 1:200，P16 1:1000)4℃結(jié)合過(guò)夜，TBS洗滌3遍，每遍10min，加入二抗(1:2000)，室溫孵育2h，ECL試劑盒顯色，圖像分析儀掃描成像，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)衰老人成纖維細(xì)胞中β-catenin、c-myc mRNA表達(dá)變化:取2～8代人成纖維細(xì)胞按1×106個(gè)每皿接種于直徑100mm培養(yǎng)皿中，接種后24h細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合，在40mJ/cm2UVB紫外線(xiàn)下照射，于照射后第0、12、24、48、72h采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA根據(jù)Genbank中β-catenin、c-myc和GAPDH的cDNA序列設(shè)計(jì)如下引物(上海生工公司合成)。Β-catenin(120bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)， c-myc(313bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)，GAPDH(289bp)引物:5'-TGG ACT CTG GAA TCC ATT CTG-3'(F)， 5'-AAA ATC CCT GTT CCC ACT CA-3'(R)。以GAPDH為內(nèi)參，圖像分析儀掃描成像，ImageQuant軟件半定量分析。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 人皮膚成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng):采用組織塊法培養(yǎng)第4天開(kāi)始有細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，第10～14天細(xì)胞長(zhǎng)至融合，長(zhǎng)梭形細(xì)胞中間可見(jiàn)鋪路石樣細(xì)胞表皮細(xì)胞，將融合細(xì)胞按1:3進(jìn)行傳代，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)加速第2天可融合，從第2代開(kāi)始細(xì)胞呈典型的長(zhǎng)梭形，鋪路石樣表皮細(xì)胞消失。

2.2 UVB誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老及β-gal半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色:UVB20～40mJ/cm2能量照射后可見(jiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)停滯呈典型衰老形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)上變得寬大扁平，胞漿透明，胞核內(nèi)顆粒增多， (圖1①～②)。β-gal半乳糖苷酶細(xì)胞衰老染色可見(jiàn)典型衰老細(xì)胞核周染成藍(lán)色，對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性率為(18.23±3.24)%，誘導(dǎo)衰老組陽(yáng)性率為(88.75±5.32)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1③。

2.3 誘導(dǎo)衰老細(xì)胞中P16蛋白的表達(dá):UVB誘導(dǎo)衰老后第12h開(kāi)始衰老相關(guān)基因P16表達(dá)增加，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)量也增加，至照射后24h開(kāi)始P16表達(dá)明顯高于照組前細(xì)胞(見(jiàn)圖2)。

2.4 UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老后β-catenin、c-myc蛋白水平變化:UVB40mJ/cm2照射人皮膚成纖維細(xì)胞后從第12h開(kāi)始β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)水平分別開(kāi)始降低，至照射后第72h這兩種蛋白的表達(dá)水平降至最低(見(jiàn)圖3)。

2.5 UVB誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老后β-catenin、c-myc mRNA水平變化:UVB40mJ/cm2照射人皮膚成纖維細(xì)胞后β-catenin、c-myc mRNA表達(dá)水平分別從照射后第48、24h開(kāi)始降低，至照射后第72h降至最低(見(jiàn)圖4)。

3討論

β-catenin基因位于3p21，全長(zhǎng)40 992 bp，人類(lèi)的β-catenin基因產(chǎn)物是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為88 000的蛋白質(zhì)，呈高度進(jìn)化保守性，大約保留了果蠅80%的同源蛋白，與鼠的β-catenin幾乎完全同源[6]。β-catenin是Wnt通路的核心信號(hào)分子，以往研究表明[7]β-catenin基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵的作用。最近研究報(bào)道[8]在人皮膚黑色素細(xì)胞瘤中β-catenin高表達(dá)并可以抑制衰老相關(guān)基因P16的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞不發(fā)生衰老保持永生化狀態(tài)，β-catenin上調(diào)其下游基因c-myc、cyclinD1的表達(dá)啟動(dòng)腫瘤的發(fā)生。而在β-catenin基因敲除小鼠黑色素細(xì)胞瘤中P16表達(dá)呈劑量依賴(lài)性增加[9]。在臨床上黑色素細(xì)胞瘤多發(fā)生于紫外線(xiàn)所照不到的地方，且在紫外線(xiàn)照不到的部位β-catenin基因高表達(dá)，這說(shuō)明β-catenin基因的表達(dá)和降解與紫外線(xiàn)照射之間存在著一定的關(guān)系。

研究報(bào)道[10]Braf誘導(dǎo)的衰老在哺乳動(dòng)物中是限制癌前病變的生理機(jī)制，由于紫外線(xiàn)照射以后Braf基因的突變刺激P16的過(guò)度表達(dá)，細(xì)胞隨后進(jìn)入衰老狀態(tài)，而在日光保護(hù)部位Braf基因突變減少，P16的過(guò)度表達(dá)也不能被很好的誘導(dǎo)[11]。在非日光暴露部位β-catenin基因抑制P16的表達(dá)，使衰老延遲，但同時(shí)也增加了其發(fā)生腫瘤的機(jī)會(huì).而日光暴露部位因?yàn)棣耤atenin基因表達(dá)減少，導(dǎo)致P16高表達(dá)，使衰老提前發(fā)生。我們的研究證實(shí)通過(guò)紫外線(xiàn)照射以后成纖維細(xì)胞形態(tài)變的寬大扁平，胞漿透明，胞核顆粒增多，呈現(xiàn)典型的衰老表現(xiàn)，衰老相關(guān)基因P16蛋白表達(dá)也增高，而β-catenin基因和其下游基因c-myc在蛋白水平和mRNA水平表達(dá)均明顯降低，且隨著衰老時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)水平降低越明顯，這樣就顯著降低了其發(fā)生腫瘤的可能性。

在我們的研究中對(duì)紫外線(xiàn)誘導(dǎo)人皮膚成纖維細(xì)胞衰老的機(jī)制進(jìn)行的初步研究，并發(fā)現(xiàn)β-catenin、c-myc基因在紫外線(xiàn)照射以后呈時(shí)間依賴(lài)性減少，為以后光療治療腫瘤提供了依據(jù)。但對(duì)紫外線(xiàn)照射通過(guò)何種途徑誘導(dǎo)β-catenin及其下游基因c-myc減少則沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步的研究;而且臨床上體表皮膚腫瘤多發(fā)生于老年人這和我們的研究結(jié)果存在矛盾，這其中的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]李春雨，張麗宏，張寧，等. 紫外線(xiàn)誘導(dǎo)皮膚光老化的形成機(jī)制[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2009，18(3):419-416.

[2]Yaar M，Gilchrest BA.Photoageing:mechanism，prevention and therapy[J]. Br J Dermatol，2007，157:874-887

[3]Williams M， Ouhtit A. Towards a better understanding of the molecular mechanisms involved in sunlight induced melanoma[J]. Biomed Biotechnol，2005:57-61.

[4]Dekker P，Andrea B，Van Heemst D，et al. Stress-induced responses of human skin fibroblasts in vitro reflect human longevity[J]. Aging Cell，2009，8(5):595-603.

[5]Majora M， Wittkampf T，Schuermann B，et al. Functional consequences of Mitochondrial DNA Deletions in Human Skin fibroblasts[J]. Am J Pathology，2009，175(3):1019-1030.

[6]胡孝輝，方勇. 毛囊干細(xì)胞及其增殖分化的研究進(jìn)展[J].中華燒傷雜志，2009，25(2):156-158.

[7]Polakis P. more than one way to Skin a Catenin[J]. Cell，2001，105:563-566.

[8] Larue L，Delmas V. The WNT/β-catenin pathway in melanoma [J]. Biosci，2006，11:733-742.

[9]Delmas V，Beermann F，Martinozzi S，et al. β-Catenin induces immortalization of melanocytes by suppressing p16INK4a expression and cooperates with N-Ras in melanomaI development[J]. Genes Dev，2007，21:2923-2935.

[10]Li W，Sanki A，Karim RZ，et al. The role of cell cycle regulatory proteins in the pathogenesis of melanoma[J]. Pathology，2006，38:287-301.

[11]Demirkan N， Kesen Z， Akdag B，et al. The effect of the sun on expression of β-catenin， p16 and cyclin d1 proteins in melanocytic lesions[J]. Clin Exper Dermatol，2007，32:733-739.

[收稿日期]2010-01-26 [修回日期]2010-04-13

編輯/張惠娟

注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文