熱休克蛋白90促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合的作用研究

[摘要]目的:研究HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中的作用。方法:在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠背部做d=2cm的全層皮膚缺損模型，并隨機(jī)分為四組:空白組(B組)、HSP90組(C組)、胰島素組(D組)及HSP90與胰島素聯(lián)合用藥組(E組)。另設(shè)一組正常大鼠同樣在背部做d=2cm全層皮膚缺損模型作為對(duì)照組(A組)，每組n=(5n1+n2)=20只，共100只大鼠，在創(chuàng)面形成后即時(shí)給予難愈創(chuàng)面藥物治療持續(xù)2天，A組則不治療。于創(chuàng)面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進(jìn)行大體觀(guān)察及活體取材做常規(guī)病理學(xué)觀(guān)察，各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)本采用免疫組化ABC法觀(guān)察HSP90，并計(jì)算其平均密度值及積分光密度值，觀(guān)察其表達(dá)規(guī)律。結(jié)果:大體觀(guān)察下，在計(jì)算第21天的創(chuàng)面愈合率后我們發(fā)現(xiàn)， C組(85.9%)、D組(86.8%)及E組(96.8%)相較于B組(79.7%)創(chuàng)面愈合率均有顯著提高(P<0.05)，其中E組療效更加突出;而在鏡下觀(guān)察中，我們發(fā)現(xiàn)E組創(chuàng)面表皮增厚，上皮化活躍，表皮細(xì)胞排列規(guī)則，且HSP90在各時(shí)期的表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)，C組與D組雖也有類(lèi)似改變但不如E組顯著。結(jié)論:HSP90能夠提高糖尿病難愈性創(chuàng)面21天的愈合率，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)將HSP90與胰島素聯(lián)合應(yīng)用后會(huì)取得更好效果，進(jìn)一步提高創(chuàng)面21天時(shí)的愈合率。

[關(guān)鍵詞]熱休克蛋白90(HSP90);糖尿病;難愈創(chuàng)面;創(chuàng)面愈合

[中圖分類(lèi)號(hào)]R622 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455(2010)05-0691-04

Heat shock protein 90 promotes wound healing in the diabetic rats

REN Jing，ZENG Hai-feng，XIA Wei，LIU Bei，LI Yong

(Institute of Plastic Surgery of People's Liberation Army，Xijing Hospitol，the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaanxi，China)

Abstract:ObjectiveHeat shock protein 90 (HSP90) could promote human epidermal cell migration in hypoxia which is the essential processes for skin wound healing. These processes are often disrupted in diabetic chronic wounds， causing patients morbidity and fatality. So we want to find out whether HSP90 could promote the epidermal cell migeration in the diabetic wound. Methods A d=2cm-sized stented wound were created in 80 streptozotocin-induced rats. A total of 100 diabetic wounds were studied in 5 groups (n = 20). The group B is blank Vaseline， the group C is 1μg/ml HSP90 plus Vaseline， the group D is 30μg/ml insulin plus Vaseline， the group E is 1μg/ml HSP90 and 30ug/ml insulin plus Vaseline. And we set group A as control group that is normal rats without treatment. We rubbed these kinds of Vaseline into the diabetic rat's wounds for 2 days. We used a group of normal rats without therapy as controls. The state of the wound healing was observed， and the percent of wound healing determined by measuring its size and by performing a histopathologic study. The statistical analyses were performed by t-test， using SPSS 14.0 software. On the 3th， 5th，7th， 10th， 14th and 21th， we tested the wound tissues by immunohistochemical staining and calculated integrated optical density (IOD) and density mean(DM)by image pro plus 6.0 software. Results On the 21th day， the wound closure rates of the group C(85.9%)，D (86.8%)and E(96.8%) is significantly higher than group B(79.7%) (P<0.01)， The IOD and DM of HSP90 positive rate of group B was lower than in the groupC，D and E (P<0.05).ConclusionThe HSP90 combined insulin could have more effects for chronic wound healing in the diabetic rats. The results is suggested that HSP90 could promote chronic diabetic wound healing.

Key words: heat shock protein90(HSP90);diabetic wound;wound healing;diabetes

糖尿病造成的難愈創(chuàng)面已成為目前臨床治療的一大難題，研究表明，高糖會(huì)抑制人表皮細(xì)胞的遷移，從而導(dǎo)致創(chuàng)面上皮化延遲[1-2]。近來(lái)，Li.W的研究發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移[3]，而關(guān)于其是否能夠有效促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的研究并未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在將HSP90應(yīng)用于糖尿病性難愈創(chuàng)面，并輔以胰島素作為參照，以觀(guān)察不同時(shí)期各組創(chuàng)面的愈合程度及創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)含量。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及分組:選用健康清潔級(jí)雄性SD大鼠100只，由第四軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，體重(200±3)g，分為A、B、C、D、E五組，每組20只。A組為正常創(chuàng)面但不予以任何治療，即對(duì)照組;B組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予空白凡士林藥膏治療組，即空白組;C組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90的凡士林藥膏治療組，即HSP90組(HSP90濃度:1μg/ml);D組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有胰島素的凡士林藥膏治療組(胰島素濃度:30μg/ml)E組為糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面給予含有HSP90及胰島素的凡士林藥膏治療組，即聯(lián)合用藥組(E組，HSP90濃度:1μg/ml，胰島素濃度:30μg/ml)。每組n=(5n1+n2)=20只，共100只大鼠，

1.1.1 構(gòu)建2型糖尿病難愈創(chuàng)面模型:采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)法誘導(dǎo)2型糖尿病造模。各組提前4周高脂高糖飲食，饑餓12h后以40mg/kg腹腔注射STZ并維持高脂高糖飲食，并于注射后48h用強(qiáng)生穩(wěn)步血糖儀檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG值>16.7mmol/L，體重明顯下降(>50g)為造模成功[4]。三天后補(bǔ)注STZ(以10～20mg/kg體重劑量腹腔注射)，并測(cè)量FBG值。切取全層皮膚暴露肉膜為準(zhǔn)后以d=2cm的金屬環(huán)間斷縫合固定于創(chuàng)緣，防止創(chuàng)面攣縮。

1.1.2 給藥及分組:A組不涂抹任何藥物;B組為空白藥膏;C組為含有濃度1μg/ml HSP90的藥膏;D組為含有濃度30μg/ml胰島素的藥膏;E組為含有1μg/ml HSP90及30μg/ml胰島素的藥膏。各給藥組均以外用涂抹局部給藥，藥膏均勻覆蓋整個(gè)創(chuàng)面(約1g/次)為準(zhǔn)(含有藥物的藥膏均委托金花生物制藥集團(tuán)有限公司完成)。HSP90的濃度為我們參考了Li.W試驗(yàn)中用于正常創(chuàng)面的治療濃度后[3]，并以15只糖尿病大鼠給予1μg/ml，5μg/ml，10μg/ml進(jìn)行了簡(jiǎn)單的預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三種濃度的效果并無(wú)顯著差異，所以取最小濃度。

6941，

2實(shí)驗(yàn)過(guò)程及觀(guān)察設(shè)計(jì)

在創(chuàng)面形成后即時(shí)給予難愈創(chuàng)面藥物治療持續(xù)2天，A組則不治療，動(dòng)物創(chuàng)面予以暴露。創(chuàng)面的固定環(huán)會(huì)于創(chuàng)面形成后的第10天予以摘除，因?yàn)榇藭r(shí)皮膚攣縮力量較大，會(huì)導(dǎo)致縫合線(xiàn)斷裂，為統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)予以摘除。并創(chuàng)面形成后第3天、第5天、第7天、第10天、第14天及第21天進(jìn)行大體觀(guān)察及活體取材做常規(guī)病理學(xué)觀(guān)察，在第3天、第5天、第7天、第10天及第14天5個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取n1=3個(gè)標(biāo)本，而在第21天取n2=5個(gè)標(biāo)本，各標(biāo)本取材時(shí)取全層厚皮膚，保留創(chuàng)緣約1～2mm的正常皮膚。

2.1 大體觀(guān)察指標(biāo):分別于用藥后第3、5、7、10、14、21 進(jìn)行大體拍照觀(guān)察并采用ADOBE photoshop cs4 計(jì)算各時(shí)期的創(chuàng)面愈合率;

2.2 鏡下觀(guān)察指標(biāo):并于3、5、7、10、14、21天取創(chuàng)面標(biāo)本，3、5、7、10、14天每組各時(shí)間點(diǎn)3只，21天時(shí)每組5只。皮膚標(biāo)本剪成橫斷面，標(biāo)本均用1%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，分別進(jìn)行HE染色、并使用ABC法進(jìn)行HSP90的免疫組化染色。并采用image pro plus 6.0彩色圖像分析系統(tǒng)， 每張切片選取5個(gè)有代表性的200倍視野，測(cè)量每個(gè)標(biāo)本HSP90陽(yáng)性表達(dá)密度及積分光密度IOD值的均值并記錄。

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì):所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS11。文中數(shù)據(jù)以均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s) 表示，并且對(duì)創(chuàng)面愈合率采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 大鼠創(chuàng)面愈合率差異比較:各組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面愈合率比較見(jiàn)表1。由表可見(jiàn)，單獨(dú)使用HSP90(C組)及單獨(dú)使用胰島素(D組)均能夠提高創(chuàng)面的愈合率(與同期B組相比，P<0.05); HSP90及胰島素聯(lián)合應(yīng)用(E組)后創(chuàng)面愈合率的提高更為顯著(與同期B組相比，P<0.01)并達(dá)到正常大鼠的創(chuàng)面愈合率(與同期A組相比，P>0.05)。但均能夠優(yōu)于空白藥物組(P<0.01)。

3.2 各組創(chuàng)面第10天時(shí)HSP90的免疫組化對(duì)比:見(jiàn)圖1～5。由圖可見(jiàn)，聯(lián)合用藥組及正常創(chuàng)面對(duì)照組創(chuàng)面中，HSP90的陽(yáng)性表達(dá)較為強(qiáng)烈。

3.3 HSP90陽(yáng)性表達(dá)的比較:為更加客觀(guān)的反應(yīng)HSP90在創(chuàng)面中的陽(yáng)性表達(dá)狀況我們選取平均陽(yáng)性率及積分光密度作為指標(biāo)[5-6]。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)HSP90平均陽(yáng)性率(Density Mean，DM)值的比較見(jiàn)圖6。各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)面中HSP90的平均積分光密度(Identical Optical density，IOD)的比較見(jiàn)圖7。

由圖6、圖7我們發(fā)現(xiàn):①在糖尿病大鼠創(chuàng)面中，HSP90的表達(dá)明顯下調(diào)(同期對(duì)照組相比，P<0.01)，而使用胰島素改善創(chuàng)面的局部高糖微環(huán)境后，HSP90的陽(yáng)性表達(dá)有所上調(diào)(同期對(duì)照組相比，P<0.05);②提高創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)后，同期創(chuàng)面的愈合率也能夠得到明顯改善(同期對(duì)照組相比，P<0.05);③聯(lián)合應(yīng)用HSP90及胰島素后，創(chuàng)面中HSP90持續(xù)過(guò)表達(dá)，且創(chuàng)面愈合率也是各難愈創(chuàng)面組中最高的，接近正常創(chuàng)面的愈合率(同期對(duì)照組相比，P>0.05);④HSP90在正常創(chuàng)面中，其表達(dá)在傷后第3天就為一個(gè)高峰，之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì);而在難愈創(chuàng)面中，其表達(dá)規(guī)律呈拋物線(xiàn)規(guī)律?？瞻捉M在整個(gè)創(chuàng)面愈合時(shí)期，HSP90陽(yáng)性表達(dá)率都明顯下調(diào)(P<0.01)，而在單獨(dú)使用HSP90或胰島素時(shí)，HSP90的表達(dá)有所上升，高峰出現(xiàn)時(shí)間約為創(chuàng)傷第14天左右;而聯(lián)合應(yīng)用這兩種藥物后，不僅HSP90的表達(dá)大大提升，并且HSP90的表達(dá)峰值也有所提前，至第10天左右。

4討論

美國(guó)創(chuàng)面愈合協(xié)會(huì)的資料顯示大約有66%的難愈性創(chuàng)面即使經(jīng)過(guò)6個(gè)月的治療護(hù)理仍無(wú)法治愈[7]，僅處理創(chuàng)面的材料每年就花費(fèi)90億美元[8]。糖尿病創(chuàng)面的治療一直是難題，表皮細(xì)胞遷移遲緩也是其發(fā)生機(jī)制的一個(gè)重要特點(diǎn)。 在糖尿病創(chuàng)面的臨床治療中，胰島素的局部應(yīng)用的療效及作用機(jī)制均得到了驗(yàn)證，這一方法也成為了臨床治療糖尿病創(chuàng)面的經(jīng)典方法。而其作用機(jī)制主要在于降低創(chuàng)面組織血糖濃度，加快糖尿病創(chuàng)面的新生毛細(xì)血管形成，促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖與遷移[9-10]。

2007年DR. Woodley等發(fā)現(xiàn)人表皮細(xì)胞受到缺氧刺激后，會(huì)大量分泌HSP90α，在胞外的HSP90α能夠有效促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移，并將其應(yīng)用于正常創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)HSP90α能夠加速創(chuàng)面的再上皮化過(guò)程[3，11]。在此之前，人們對(duì)于HSP90的關(guān)注了解更多的集中在癌癥領(lǐng)域，作為重要的分子伴侶，它介導(dǎo)了多條調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移的信號(hào)通路[12]，并保護(hù)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，抵抗各類(lèi)損傷帶給機(jī)體的不可逆性傷害[13]

在本實(shí)驗(yàn)中我們主要為了研究HSP90是否能夠促進(jìn)糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合，并觀(guān)察HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中的表達(dá)，探索HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá)是否與創(chuàng)面的愈合速率有關(guān)聯(lián)。我們的研究發(fā)現(xiàn):在大體觀(guān)察下，①外源性給予糖尿病性難愈創(chuàng)面HSP90，同期的創(chuàng)面愈合率有所提高(與同期空白組相比，P<0.05);②聯(lián)合應(yīng)用胰島素及HSP90后，糖尿病性難愈創(chuàng)面的同期愈合率最高(與同期對(duì)照組相比，P>0.05)。僅從大體實(shí)驗(yàn)的觀(guān)察結(jié)果我們認(rèn)為，創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)與糖尿病難愈創(chuàng)面的愈合是存在相關(guān)性的。在鏡下觀(guān)察，我們發(fā)現(xiàn):①糖尿病性難愈創(chuàng)面的高糖微環(huán)境明顯抑制了HSP90的表達(dá)(空白組與同期對(duì)照組相比，P<0.01)，局部使用胰島素改善創(chuàng)面高糖微環(huán)境或局部給予HSP90后，糖尿病性難愈創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)有所提高(與同期空白組相比，P<0.05);②將HSP90與胰島素聯(lián)合應(yīng)用后則發(fā)現(xiàn)糖尿病性難愈創(chuàng)面中HSP90持續(xù)性過(guò)表達(dá)(與同期對(duì)照組相比，P<0.01)，并且其表達(dá)高峰也有所提前。

分析結(jié)果我們認(rèn)為，高糖環(huán)境會(huì)降低HSP90在創(chuàng)面中的表達(dá)，減弱HSP90對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。并且創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)高低與創(chuàng)面的愈合速率具有相關(guān)性。雖然無(wú)論是局部給予胰島素改善高糖微環(huán)境，還是局部應(yīng)用HSP90提高創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)，均能夠提高糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合率，但是我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用后糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合效果最好。據(jù)此我們認(rèn)為，胰島素改善了糖尿病性難愈創(chuàng)面的局部微環(huán)境，有利于創(chuàng)面中HSP90的表達(dá)提高，進(jìn)一步局部給予HSP90，提高創(chuàng)面中HSP90的含量，從而激活部分HSP90參與調(diào)控的信號(hào)通路，提高創(chuàng)面中各類(lèi)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)了糖尿病性難愈創(chuàng)面的愈合。

然而，我們的研究尚屬淺顯，對(duì)于HSP90在糖尿病創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用機(jī)制也未進(jìn)行研究。但是，依然為我們尋找糖尿病創(chuàng)面的治療方向提供了一個(gè)具有臨床應(yīng)用意義的思路。下一步，我們會(huì)對(duì)HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，探索HSP90在糖尿病性難愈創(chuàng)面中所調(diào)控的與創(chuàng)面愈合密切相關(guān)的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞外基質(zhì)的變化。并且HSP90的提取目前還很昂貴，所以進(jìn)一步尋找到其穩(wěn)定的上游信號(hào)分子或?qū)ふ乙环N能夠有效且廉價(jià)的提取HSP90的方法會(huì)成為我們今后的研究方向。

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[收稿日期]2010-02-26 [修回日期]2010-04-20

編輯/張惠娟

注:本文中所涉及到的圖表、注解、公式等內(nèi)容請(qǐng)以PDF格式閱讀原文