丙肝合劑對(duì)不同基因型丙型肝炎病毒復(fù)制子基因表達(dá)的影響

李京濤等

摘要：目的 通過體外實(shí)驗(yàn)探討丙肝合劑抑制不同基因型丙型肝炎病毒（HCV）復(fù)制子基因表達(dá)的機(jī)制。方法 建立不同基因型HCV復(fù)制子細(xì)胞模型，按基因型不同分為HCV 1b組、HCV 2a組和J6/JFH1組，不同濃度丙肝合劑干預(yù)負(fù)載復(fù)制子的Huh7.5.1細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞裂解液，進(jìn)行熒光素酶活性測定，MTT法檢測細(xì)胞毒性。選擇IFN-2α和DMSO分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照以排除實(shí)驗(yàn)誤差。結(jié)果 3組熒光素酶活性呈劑量依賴性下降，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多重比較顯示，HCV 2a組熒光素酶活性顯著低于HCV 1b組和J6/JFH1組（P<0.05）。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙肝合劑濃度達(dá)到0.2 g/mL時(shí)，細(xì)胞存活率超過99%。結(jié)論 丙肝合劑能部分抑制不同基因型HCV結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)HCV 2a復(fù)制子抑制作用最強(qiáng)，丙肝合劑達(dá)到有效抑制作用的濃度為0.1 g/mL。

關(guān)鍵詞：丙肝合劑；丙型肝炎病毒；復(fù)制子系統(tǒng)；基因表達(dá)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.08.021

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2015）08-0077-04

Effects of Hepatitis C Mixture on RNA Expression of Different Genotypic HCV Replicons LI Jing-tao1， WEI Hai-liang1， XI Qi1， LIU Ya-zhu1， YAN Shu-guang2， HUI Yi2， SONG Chun-rong1， LI Ri-xiang1， CHANG Zhan-jie1 （1.The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China；2.Shaanxi University of Chinese Medicine， Xianyang 712000， China）

Abstract：Objective To investigate the inhibition mechanism of Hepatitis C Mixture for RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro. Methods Different genotypic HCV replicon cell models were established. According to the disparity of genotypes， they were divided into three groups which named HCV 1b， HCV 2a and J6/JFH1. The Huh7.5.1 cell colonies which contain HCV replicon RNA were treated with various concentrations of Hepatitis C Mixture for 48 h. Then the luciferase activity and cytotoxicity of cell colonieswere detected. MTT method was used to detect cytotoxicity. IFN-2α and DMSO were selected as positive and negative control for eliminating the experiment errors. Results Luciferase activities of three groups showed a dose dependent decrease. Luciferase activities of three groups were significant different （P<0.05）. Multiple comparisons were performed and showed the luciferase activity of HCV 2a group was lower than those in HCV 1b and J6/JFH1 groups （P<0.05）. The results of MTT showed that when cells were treated with 0.2 g/mL of Hepatitis C Mixture， cellular survival rate was higher over 99%. Conclusion Hepatitis C Mixture could partly inhibit the RNA expression of different genotypic HCV replicons in vitro， especially the HCV 2a replicon. The optimal inhibitory concentrations of Hepatitis C Mixture is 0.1 g/mL.

Key words：Hepatitis C Mixture；hepatitis C virus；replicon system；RNA expression

基金項(xiàng)目：陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃（2013JK0815）；咸陽市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃（2014K04-04）；陜西中醫(yī)學(xué)院自然科學(xué)創(chuàng)新基金（14XJZR08）；陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院科研課題（2014-34）

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一，根據(jù)HCV病毒株核苷酸的同源性差異，目前可將其分為6個(gè)基因型及其不同亞型[1]。目前，臨床上應(yīng)用中藥和中成藥治療丙型病毒性肝炎較普遍，在保肝、抗病毒方面均取得了一定效果[2-3]。但傳統(tǒng)中醫(yī)大多采用復(fù)方制劑進(jìn)行臨床治療，對(duì)相關(guān)作用機(jī)理很難闡述清楚[4]。丙肝合劑是我院肝病科有效驗(yàn)方，前期臨床研究結(jié)果顯示，丙肝合劑具有一定的抗HCV作用[5]。為進(jìn)一步明確丙肝合劑抗HCV的作用機(jī)制，本研究利用不同基因型HCV復(fù)制子系統(tǒng)，體外研究丙肝合劑對(duì)HCV復(fù)制子基因表達(dá)的抑制作用，為中藥治療丙型病毒性肝炎研究提供新的思路和方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

Huh7.5.1細(xì)胞株來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝病中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物

丙肝合劑由黃芪、黨參、白術(shù)、靈芝、丹參、枳殼等組成，陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供。藥物分別按照比例稱重、混合，水煎2次，每次30 min，過濾、濃縮至每克含原藥材8 g，凍干粉密封，4 ℃冰箱保存，使用時(shí)100 ℃水溶解，配置成0.5、1.0 g/mL濃度的藥液。

1.3 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶ScaⅠ和熒光素酶檢測試劑盒，Promega公司；酚-氯仿-異戊醇（體積比25∶24∶1）及l(fā)ipofectamine 2000，Invitrogen公司；DMEM和FBS，GIBICO公司；MEGAscript T7 kit，Ambion公司；胰酶、EDTA和G418，Sigma公司；DNA marker和蛋白酶K，Takara公司；RNA marker，NEB公司。RNeasy Mini Kit，QIAgen公司；去DNA酶及RNA酶耗材，Axygen公司，可處理的試劑均經(jīng)DEPC水或去DNA酶及RNA酶處理；HCV1b、2a和J6/JFH1復(fù)制子（1b/2a嵌合）均來自南方醫(yī)科大學(xué)肝病中心實(shí)驗(yàn)室。GeneAmp PCR system 9700（美國Applied Biosystems），低溫高速離心機(jī)（Hema 德國），Genios Pro型Tecan酶標(biāo)儀（美國Tecan公司），普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），Nikon倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司），Milli-Q超純水器（美國Millipore公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 復(fù)制子質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄、純化與轉(zhuǎn)染

HCV復(fù)制子質(zhì)粒體外單酶切線性化，純化回收后，采用MEGAscript T7 kit試劑盒體外轉(zhuǎn)錄HCV RNA， QIAgen純化試劑盒進(jìn)行純化，定量。采用lipofectamine 2000，將轉(zhuǎn)錄的HCV RNA分別轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞系。

2.2 復(fù)制子瞬時(shí)復(fù)制效率檢測

體外轉(zhuǎn)錄的HCV RNA轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4、24、48、72 h后收集細(xì)胞裂解液，檢測熒光素酶活性。

2.3 RT-PCR檢測細(xì)胞中HCV NS5A

篩選得到的陽性細(xì)胞株重新接種6孔板，待細(xì)胞長滿后，RNeasy Mini Kit試劑盒提取細(xì)胞總RNA， RT-PCR檢測HCV NS5A片段，RT-PCR反應(yīng)條件和引物采用已建立的方法[6]。

2.4 HCV復(fù)制子RNA表達(dá)

將負(fù)載重組HCV復(fù)制子的Huh7.5.1陽性克隆細(xì)胞以2×104/孔的密度接種至24孔板中，加入DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長到滿度為60%時(shí)，用倍比稀釋的丙肝合劑處理細(xì)胞48 h，進(jìn)行熒光素酶活性測定，細(xì)胞上清RNA測定，繪制體外藥物抗病毒的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)曲線。為排除實(shí)驗(yàn)誤差，設(shè)立空白對(duì)照、陰性對(duì)照（DMSO）和陽性對(duì)照（IFN-2α）。

2.5 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

將HCV復(fù)制子轉(zhuǎn)染的Huh7.5.1細(xì)胞接種至96孔板，設(shè)丙肝合劑和DMSO對(duì)照組，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)，在酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和析因設(shè)計(jì)資料的方差分析。對(duì)每個(gè)濃度藥物干預(yù)Huh7.5.1的結(jié)果采用單因素方差檢驗(yàn)，先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，整體比較時(shí)方差齊同F(xiàn)檢驗(yàn)，方差不齊近似F檢驗(yàn)Welch法，多重比較時(shí)方差齊同LSD法，方差不齊Dunnett'T3法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 HCV復(fù)制子系統(tǒng)的建立

不同基因型HCV復(fù)制子RNA轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4、24、48、72 h后檢測熒光素酶活性值，設(shè)定4 h的熒光素酶活性值為1，以24、48、72 h的熒光素酶活性值與該值的比值反映瞬時(shí)復(fù)制效率，見圖1。轉(zhuǎn)染72 h時(shí)細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增HCV NS5A基因全長，電泳結(jié)果見圖2。

4.2 丙肝合劑對(duì)HCV復(fù)制子基因表達(dá)的影響

以不同濃度的丙肝合劑（0.001、0.01、0.1 g/mL）處理HCV復(fù)制子細(xì)胞48 h后，收集細(xì)胞，測定熒光素酶活性來檢測不同濃度丙肝合劑對(duì)HCV復(fù)制的抑制效果。設(shè)定0 g/mL的熒光素酶活性值為1，以其他濃度的熒光素酶活性值與該值的比值反映復(fù)制效率，見圖3。為排除實(shí)驗(yàn)誤差，在進(jìn)行丙肝合劑倍比稀釋干預(yù)不同基因型HCV復(fù)制子細(xì)胞時(shí)，均選擇IFN-2α 50 U作為陽性藥物進(jìn)行對(duì)照，48 h后熒光素酶活性均降低50%，陰性對(duì)照（DMSO），熒光素酶活性無明顯下降。

3組間比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，不同組間差異顯著（P<0.05），不同藥物濃度間差異顯著（P<0.01），見表1。

丙肝合劑0.1 g/mL干預(yù)時(shí)，3組整體比較，P<0.05，整體上均數(shù)差異顯著。進(jìn)一步多重比較采用LSD法，HCV 1b組與HCV 2a組間比較差異顯著（P<0.05），HCV 2a組與J6/JFH1組間比較差異顯著（P<0.05），而HCV 1b組和J6/JFH1組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。

4.3 丙肝合劑的細(xì)胞毒性

以不同濃度的丙肝合劑（0.2、0.4、0.6、0.8、1 g/mL）處理Huh7.5.1細(xì)胞72 h后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。丙肝合劑的細(xì)胞毒性隨藥物濃度的增加而增大，細(xì)胞存活率依次為99.98%、88.65%、76.33%、47.46%、23.82%。

5 討論

HCV復(fù)制子帶有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neor）基因作為篩選標(biāo)志、蟲熒光素酶（Luc）基因作為報(bào)告基因，可在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定、高效地復(fù)制表達(dá)，并可檢測HCV亞基因組，可用于HCV小分子抗病毒藥物的篩選及HCV亞基因組RNA和非結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)的研究[4，6]。本研究采用不同基因型的HCV 1b、HCV 2a和J6/JFH1復(fù)制子系統(tǒng)，可用于中草藥及其提取物抗病毒藥物篩選和相關(guān)機(jī)制研究。

本研究通過將不同基因型的HCV復(fù)制子重組體轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞系，不同濃度的丙肝合劑加入Huh7.5.1細(xì)胞中，采用RT-PCR和熒光定量檢測Huh7.5.1細(xì)胞中HCV基因表達(dá)情況。結(jié)果顯示，不同濃度的丙肝合劑處理HCV復(fù)制子細(xì)胞后，3組熒光素酶活性呈現(xiàn)劑量依賴性的下降，反映出丙肝合劑對(duì)HCV復(fù)制的抑制作用呈劑量依賴性增加，其中丙肝合劑對(duì)HCV 2a復(fù)制子RNA的抑制作用最強(qiáng)，用0.1 g/mL濃度干預(yù)時(shí)，HCV 2a復(fù)制子RNA復(fù)制率被抑制約50%，而3組整體比較和多重比較的結(jié)果顯示，HCV 2a組的病毒量顯著低于HCV 1b和J6/JFH1組，其他2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明丙肝合劑對(duì)HCV 2a復(fù)制子RNA的抑制作用最強(qiáng)，其次為J6/JFH1，然后是HCV 1b。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，丙肝合劑的細(xì)胞毒性雖然隨著藥物濃度增大而增大，但當(dāng)培養(yǎng)72 h后，丙肝合劑的濃度達(dá)到0.2 g/mL 時(shí)，干預(yù)Huh7.5.1細(xì)胞72 h，細(xì)胞存活率超過99%。

總之，本研究表明，丙肝合劑對(duì)HCV基因表達(dá)的抑制作用顯示，隨著藥物濃度的增加，HCV基因的轉(zhuǎn)錄水平下降，從而說明丙肝合劑能部分抑制HCV結(jié)構(gòu)基因