毛細(xì)管電泳免疫分析

[摘要] 免疫分析的歷史已經(jīng)有很長時(shí)間了，它建立在抗原抗體之間專一反應(yīng)的基礎(chǔ)上，用于檢測溶液中的抗原或抗體。免疫分析由于高度專一性，極低的檢測限，適用于廣大的化合物，因而在臨床，生物藥劑方面應(yīng)用廣泛，毛細(xì)管電泳的發(fā)展進(jìn)一步加強(qiáng)了它的分析能力。

[關(guān)鍵詞] 毛細(xì)管電泳;免疫分析

[中圖分類號(hào)] R392-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1004-8650(2009)08-040-03

1毛細(xì)管電泳免疫分析的發(fā)展

1991年Nielsen[1]等用毛細(xì)管區(qū)帶電泳與紫外檢測研究了人生長激素與其單克隆抗體的反應(yīng)。將抗原抗體混合溫育一段時(shí)間后，用CZE分離，10分鐘內(nèi)，抗原抗體復(fù)合物和游離的抗原抗體完全分離。此后，毛細(xì)管等電聚焦(CEIF)和膠束電動(dòng)色譜(MECC)等CE模式也用于分析抗原抗體復(fù)合物[2，3]。這些研究表明，抗原抗體復(fù)合物在CE中是穩(wěn)定的。因此CE可以作為免疫分析的分離方法，但由于紫外的檢測限高，特異性差，達(dá)不到免疫分析的要求，因此必須用更靈敏的檢測技術(shù)。1993年，Schultz[4]等用異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的胰島素作為示蹤物，采用CZE與激光誘導(dǎo)熒光檢測技術(shù)(LIF)進(jìn)行免疫分析，測定胰島素的濃度。之后，Chen[5]等人研究了嗎啡等濫用藥物的CZE-LIF免疫分析方法，Shimura[6]等研究了重組人生長激素的CZE-LIF免疫分析方法。LIF的用既提高了檢測靈敏度，又提高了檢測的特異性，從而使毛細(xì)管電泳免疫分析開始得到迅速發(fā)展。

2CEIA的原理

2.1非競爭性CEIA原理

非競爭性CEIA是建立在從游離的Ab和/或Ag中分離Ab-Ag復(fù)合物基礎(chǔ)上的。如果分析物本身有紫外吸收或自然的熒光，則可以直接定量。然而大多數(shù)非競爭性CEIA中的分析物不具備此條件，即使有紫外吸收的物質(zhì)，由于紫外的靈敏度只能達(dá)到10-6M，不能滿足大多數(shù)的檢測要求，所以需要用熒光試劑來標(biāo)記抗原或抗體以增加檢測靈敏度。在體系中加入過量的標(biāo)記試劑，抗原抗體都可以標(biāo)記，這樣非競爭性CEIA有兩種形式:

Ab+Ag*(過量)=Ab-Ag*+Ag*(過量)

Ab+Ab*(過量)=Ab-Ab*+Ab*(過量)

(Ab*和Ag*為標(biāo)記的抗體和抗原)

當(dāng)分析樣品中的Ab(或Ab片段)，要加入過量的Ag*，與樣品中的Ab(Ab片段)形成復(fù)合物，理論上，CE-LIF圖譜上將顯示兩個(gè)峰，即游離的Ag*和結(jié)合的Ag*，如果抗原抗體復(fù)合物在分離時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，則可以根據(jù)形成的復(fù)合物的數(shù)量或者游離的Ag*的減少量給分析物定量。

2.2競爭性CEIA原理

與普通的免疫實(shí)驗(yàn)一樣，競爭性CEIA中至少有一種成分是有限的，標(biāo)記的抗原或抗體則與分析物競爭結(jié)合此成分(抗原或抗體)。如果是已知數(shù)量的標(biāo)記抗原和有限數(shù)量的抗體與分析物混合，反應(yīng)為:

Ag+Ag*+Ab(有限)=Ab-Ag+Ab-Ag*+Ag+Ag*

CE-LIF分離混合物產(chǎn)生兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)于Ag*和Ab-Ag*，樣品中Ag存在的越多則游離的Ag*越多，形成的Ab-Ag*復(fù)合物越少。定量方法與普通的免疫分析相同。

若是一定數(shù)量的標(biāo)記抗體和有限數(shù)量的抗原與樣品混合，反應(yīng)則為:

Ab+Ab*+Ag(有限)=Ab-Ag+Ab*-Ag

分離后產(chǎn)生的兩個(gè)峰對(duì)應(yīng)于游離Ab*和Ab*-Ag復(fù)合物樣品中Ab存在的越多則游離的Ab*越多，形成的Ab*-Ag復(fù)合物越少。

在同時(shí)分析多組分時(shí)，例如:兩個(gè)結(jié)構(gòu)形似的Ags進(jìn)行標(biāo)記與樣品混合，反應(yīng)則如下:

Aga+Agb+Aga*+Agb*+Aba+Abb=Aga-Aba+Aga*-Aba+Agb-Abb+Agb*-Abb

以上反應(yīng)形式是建立在兩種抗原抗體之間無交叉反應(yīng)的基礎(chǔ)上的，理論上將得到四個(gè)峰。

3免疫分析試劑

免疫分析試劑主要包括示蹤物和特異性抗體。CEIA常用LIF檢測，標(biāo)記物是熒光染料。用于抗體標(biāo)記的染料必須具備以下條件:①能與抗原或抗體共價(jià)結(jié)合，結(jié)合后不易解離，為結(jié)合的染料及其降解產(chǎn)物易于分離;②熒光量子產(chǎn)率高，結(jié)合后無明顯下降;③熒光穩(wěn)定性好，光漂白作用弱;④不影響抗原抗體間反應(yīng)，無附加的抗原性;⑤有適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光光源可以激發(fā)。常用的熒光染料有熒光素類，羅丹明類，藻紅素類等。Chen[5]等用菁染料Cy5和Cy5.5標(biāo)記濫用藥物，這兩種染料的激發(fā)和發(fā)射波帶都在近紅外區(qū)，生物體液中的自發(fā)熒光干擾少，激發(fā)光源可以用He-Ne激光器或半導(dǎo)體激光器，是一種很有應(yīng)用前景的熒光染料。

4毛細(xì)管電泳的分離模式

理論上CE的模式都可以用于分析，如CZE，CIEF，CGE，MECC。CEIA毛細(xì)管分離時(shí)的影響因素較多:電壓，pH值，離子強(qiáng)度，溫度，溫育時(shí)間，解離常數(shù)等等，所以不論用什么模式的毛細(xì)管分離都要優(yōu)化分離條件。

5CEIA的檢測方法

免疫分析檢測按是否使用標(biāo)記物可以分為兩種:標(biāo)記和不標(biāo)記免疫分析。即使大多數(shù)的免疫分析都采用標(biāo)記技術(shù)，但是如紫外檢測的非標(biāo)記檢測技術(shù)還是很有用。在標(biāo)記免疫分析中，最普通的為:放射性免疫分析，酶免疫分析，熒光免疫分析，化學(xué)發(fā)光免疫分析，電化學(xué)免疫分析。CEIA中主要應(yīng)用的是紫外檢測和激光誘導(dǎo)熒光檢測。粒子計(jì)數(shù)也是CEIA中使用的一種專一的檢測方法。

5.1紫外吸收檢測

早期的CEIA中使用紫外吸收檢測是因?yàn)槠浜唵危?jīng)濟(jì)，易得。然而，紫外檢測器的主要缺點(diǎn)是檢測靈敏度低，紫外吸收的最小檢測濃度為10-6M。許多免疫分析實(shí)驗(yàn)要求的靈敏度水平比此大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。只有兩個(gè)大分子相互作用的才能夠用這種檢測方法，例如:Nielsen[1] 等人在200nm處監(jiān)測人生長激素和其抗體相互作用;Harrington等人在280nm處監(jiān)測酶和堿性磷酸化酶及IgG的連接[7]。

5.2LIF檢測

用LIF檢測的CE可以濃度為10-11-10-12M的熒光標(biāo)記分析物。然而此濃度的樣品直接熒光衍生化存在一個(gè)問題，即復(fù)雜樣品基質(zhì)非定量衍生化，多余的標(biāo)記試劑導(dǎo)致了檢測干擾。與這種共價(jià)衍生化相反，復(fù)雜體系通常采用生物專屬性識(shí)別的復(fù)合物形式。將生物專屬性復(fù)合物中的相互作用的分子的其中一個(gè)進(jìn)行熒光標(biāo)記，就給分析物衡量測定提供了靈敏度探針。

5.3粒子計(jì)數(shù)

激光粒子技術(shù)微免疫分析體系是由Rosenzweig 和Yeung[8]發(fā)展，用于毛細(xì)管中極端靈敏的蛋白質(zhì)分析?？乖?多為蛋白)附著到抗體涂漬的粒子上，當(dāng)遷移到檢測窗口激光束使粒子產(chǎn)生散射光，通過散射光的強(qiáng)度計(jì)數(shù)，而沒有被抗原附著的粒子在電泳中不遷移。這種方法可檢測為10-21M。這種技術(shù)比酶連免疫分析的檢測限低20倍。

6CEIA的應(yīng)用

6.1尿樣分析

1994年，Chen 和Evangelista[5]用CEIA分析了嗎啡及其他阿片類在尿中的濃度。大多數(shù)常見的濫用藥物及其代謝物在尿中的濃度范圍是1μg-1ng。藥物及其代謝物用藍(lán)染料標(biāo)記作為競爭試劑進(jìn)行免疫反應(yīng)，在內(nèi)標(biāo)存在的情況下，毛細(xì)管可以同時(shí)檢測幾種藥物，如嗎啡和PCP。但是通常尿樣中含有的熒光成分比較多，如果干擾測定，一般的解決方法是色譜分離，或者優(yōu)化分離條件，或用檢測波長不與干擾波長重疊的熒光標(biāo)記，還有人采用了固相萃取(可以測到400fmol/ml的濃度)[9]。

6.2血樣分析

Chen[5]等人通過競爭性CEIA熒光標(biāo)記抗原測定了人血漿中的谷地新至nmol水平。Liu[10]則通過EMIT反應(yīng)后CE分離酶反應(yīng)產(chǎn)物(NADP)及底物(NAD)和內(nèi)標(biāo)，通過NADP與內(nèi)標(biāo)的峰面積比建立了谷地新計(jì)量-響應(yīng)值曲線，方法專一，干擾少。

6.3淚液分析

與血樣和尿樣相比，淚液是比較難分析的，因?yàn)槠潴w積小，成分復(fù)雜。而CE分離所需的樣品量小，就很適合分析淚液。Chmielinska[11]曾報(bào)道用CEIA分析了淚液中的Cy-closporin A，顯示了CE較HPLC的優(yōu)越性，還同時(shí)測定了其毒性代謝物的血漿濃度。

7毛細(xì)管免疫分析與傳統(tǒng)免疫分析的比較

毛細(xì)管電泳(CE)是分離大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)的有力的分析技術(shù)，CE與激光誘導(dǎo)熒光檢測(LIF)聯(lián)用之后，可輕而易舉的測到10-11M濃度的物質(zhì)，與大多數(shù)的免疫分析方法相當(dāng)，最近發(fā)展的CE酶免疫分析新技術(shù)使CE可以測到更低的濃度水平，當(dāng)LIF與酶擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來，即使是單個(gè)酶也能測到。CE在分離能力和檢測靈敏度方面的優(yōu)勢(shì)使其能快速分離游離的抗原(抗體)和抗原(抗體)結(jié)合物，對(duì)免疫分析特別適用。用烷基磷酸化酶標(biāo)記的抗體，酶催化緩沖鹽中的熒光二磷酸脂鍵水解，產(chǎn)生熒光，依此檢測到抗原分析物[12]。CE的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可在線定量，微量分析，儀器自動(dòng)化。如酶免疫毛細(xì)管電泳分析已經(jīng)儀器化，改進(jìn)的EIAS用帶有生物識(shí)別部分的酶，可以進(jìn)行競爭或非競爭性反應(yīng)，簡單快速。

除上述的優(yōu)點(diǎn)之外，CE還有以下優(yōu)點(diǎn):①CEIA需要的樣品量少，試劑消耗少，一般只需要nl 樣品和μl級(jí)的緩沖液，shimura[6]等人的實(shí)驗(yàn)表明1μl標(biāo)記抗體可用于數(shù)千次的met-rhGH的分析測定;②CEIA使傳統(tǒng)分析中的煩瑣步驟得到簡化，CE分離可在幾分鐘內(nèi)完成，適合在線的LIF檢測，大大提高了分析速度，而且容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，可進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控;③CEIA可以允許同時(shí)測定多種分析物，可以同時(shí)測定血漿中的水楊酸、撲熱息痛、茶堿和奎寧丁[13]，尿中的嗎啡，PCP，THC和可卡因代謝物benzoylecgonine[14]，電動(dòng)毛細(xì)管競爭性免疫分析尿中美沙酮，阿片，安非他明和可卡因代謝物benzoylecgonine[15];④CEIA可以直接看到免疫復(fù)合物的游離和結(jié)合形式，簡化了結(jié)果說明;⑤CEIA使用的檢測技術(shù)很多，且都是現(xiàn)有的，如LIF，UV，MS;⑥免疫反應(yīng)在均相中進(jìn)行，不會(huì)由于基質(zhì)的干擾而影響反應(yīng)速度，反應(yīng)進(jìn)行的很快，一般5-10分鐘，這與普通的免疫反應(yīng)溫育幾小時(shí)或過夜相比，大大減少了所需時(shí)間;⑦CE的分離效率高，可以解決免疫分析中交叉反應(yīng)性問題。

8總結(jié)和展望

毛細(xì)管電泳免疫分析在在線免疫方面仍然有待技術(shù)突破，目標(biāo)是將反應(yīng)毛細(xì)管柱和分離毛細(xì)管柱合二為一，而不是像目前采用的基本上是接口技術(shù)。雖然毛細(xì)管免疫分析可以測到很低的濃度，但是色譜的峰形一般并不好，而且空白的血漿和尿液中的熒光干擾是一個(gè)問題，發(fā)展新的可以提高檢測靈敏度又可以避開空白干擾的標(biāo)記物也成為一個(gè)研究方向。

目前人們?nèi)栽谄诖l(fā)明新的高靈敏度低信噪比的檢測方法，以將毛細(xì)管電泳的高分離特性充分發(fā)揮出來。CEIA的主要問題是它不能像傳統(tǒng)的免疫分析方法一樣同時(shí)分析多個(gè)樣品，這可以通過發(fā)展毛細(xì)管陣列電泳，微片上的多通道電泳來解決，現(xiàn)在的主要問題是檢測系統(tǒng)不能同時(shí)檢測多個(gè)毛細(xì)管柱，而多個(gè)毛細(xì)管柱并列電泳時(shí)，熱量不易散發(fā)，會(huì)造成電泳條件不穩(wěn)定，影響電泳效果。隨著毛細(xì)管的涂漬技術(shù)，高特異性及其Fab和Fab’片段的制備與純化等相關(guān)技術(shù)的進(jìn)一步成熟，CEIA一定將會(huì)在臨床藥物生物分析等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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(收稿日期2009-04-24)